S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Dyakov
Esittely
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary, myöhäisrokotuksen aiheuttaja, taloudellisesti tärkein perunoiden ja tomaattien tauti, on herättänyt huomiota eri maiden tutkijoiden keskuudessa yli puolitoista vuosisataa. Yhtäkkiä Euroopassa XNUMX-luvun puolivälissä ilmestynyt se aiheutti perunaepidemian, joka on säilynyt monien sukupolvien muistissa.
Tähän asti sitä kutsutaan usein "irlantilaisen nälän sieneksi". Lähes sata vuotta ensimmäisten epidemioiden jälkeen löydettiin myöhäiselle särkylle vastustuskykyiset villit meksikolaiset perunalajit, kehitettiin menetelmiä niiden ylittämiseksi viljeltyjen perunoiden kanssa (Muller, 1935) ja saatiin ensimmäiset myöhään särkyä vastustavat lajikkeet (Pushkarev, 1937). Pian niiden kaupallisen viljelyn alkamisen jälkeen myöhäisrokotaudinaiheuttajan rodut, jotka olivat virulentteja vastustuskykyisille lajikkeille, kerääntyivät. ja uusien resistenssigeenien tuominen Meksikon luonnonvaraisista perunoista lajikkeisiin alkoi nopeasti menettää tehokkuutta.
Epäonnistumiset käyttämällä monogeenista (vertikaalista) resistenssiä pakottivat kasvattajat etsimään monimutkaisempia tapoja hyödyntää epäspesifistä polygeenistä (horisontaalista) resistenssiä. Viime vuosina erittäin aggressiiviset rodut ovat alkaneet kerääntyä loisen yksittäisiin populaatioihin aiheuttaen jopa epäspesifisen resistenssin eroosiota. Fungisidiresistenttien kantojen tulo on aiheuttanut ongelmia perunansuojelukemikaalien käytössä.
Johtuen merkittävistä eroista munasolujen ja sienien välillä kemiallisessa koostumuksessa, ultrakehityksessä ja aineenvaihdunnassa, sienitautien torjunta-aineet, erityisesti systeemiset, joita käytetään kasvien suojaamiseen monilta sienitauteilta, ovat tehottomia munasoluja vastaan.
Siksi myöhäisräjähdyksiä vastaan annetussa kemiallisessa suojauksessa käytettiin moninkertaista (jopa 12 kertaa vuodessa tai enemmän) ruiskutusta kosketusvalmisteilla, joilla oli laaja vaikutusalue. Vallankumouksellinen vaihe oli fenyyliamidien käyttö, jotka ovat myrkyllisiä munasoluille ja leviävät systeemisesti kasveissa. Niiden laaja käyttö johti kuitenkin nopeasti resistenttien kantojen kertymiseen sienipopulaatioihin (Davidse et ai., 1981), mikä vaikeutti merkittävästi kasvinsuojelua. P. infestans on käytännössä ainoa lauhkea lauhkea vyöhyke, jota ei voida luonnonmukaisessa maataloudessa neutralisoida ilman kemiallisten suojakeinojen käyttöä (Van Bruggen, 1995).
Edellä selitetään eri maiden tutkijoiden valtava huomio P. infestans -populaatioiden tutkimiseen, niiden runsauden ja geneettisen koostumuksen dynamiikkaan sekä vaihtelevuuden geneettisiin mekanismeihin.
R. INFESTANSin elinkaari
Oomycete Phytophthora infestans kehittää solujenvälisen myseelin perunanlehtien sisällä haustoriaa. Syöttämällä lehden kudoksiin se aiheuttaa tummien pisteiden muodostumisen, jotka muuttuvat mustiksi ja mätänevät märällä säällä. Vahvan tappion myötä koko lehti kuolee. Ruokintajakson jälkeen sienille muodostuu kasvuja - sporangioforeja - jotka kasvavat ulospäin stomatan läpi. Märällä säällä ne muodostavat valkoisen kukinnan lehtien alapuolella olevien pisteiden ympärille. Sporangioforien päihin muodostuu sitruunanmuotoisia zoosporangioita, jotka hajoavat ja kulkeutuvat sateen suihkeella (kuva 1). Sporangiat putoavat vesipisaroiksi perunanlehden pinnalle 6-8 eläintarhalla, jotka liikkumisen jälkeen ovat pyöristetyt, peitetyt kuorella ja itävät ituputkella. Itu tunkeutuu stomatan läpi lehtikudokseen. Tietyissä olosuhteissa sporangiat voivat kasvaa kasvuputkessa suoraan lehtikudokseen. Suotuisissa olosuhteissa aika tartunnasta uuden itiön muodostumiseen on vain 3-4 päivää.
Sporangiat ovat tarttuneet maahan ja suodatettu maaperän läpi tartuttamaan mukulat. Vakavasti kärsineet mukulat mätänevät varastoinnin aikana; heikosti kärsivillä infektio voi jatkua seuraavaan kauteen asti. Lisäksi myöhäisrokotuksen aiheuttaja voi jatkua talvella oosporien muodossa (paksuseinäiset leposeksuaaliset itiöt) maaperässä kasvijätteillä ja tomaatin siemenillä. Oosporit muodostuvat elävien kasvien elimiin, kun eri parittelutyyppien kannat kohtaavat liiallista kosteutta. Keväällä aseksuaalinen itiö muodostuu istutetuille tartunnan saaneille mukuloille ja kasvijätteille, joilla on oosporia; zoosporit tulevat maaperään ja aiheuttavat kasvien alempien lehtien tartunnan. Joissakin tapauksissa myseeli voi kasvaa tartunnan saaneesta mukulasta kasvin vihreää osaa pitkin ja esiintyy yleensä varren yläosassa.
Merkittävä ero munasolujen ja useimpien sienien välillä on diplomaasivaiheen vallitsevuus niiden elinkaaressa gameettisen meioosin ja sygoottien (oosporien) itämisen kanssa ilman pelkistävää ydinfissiota. Tämä ominaisuus sekä biseksuaalisuutta korvaava dipolaarinen heterotallismi näyttäisi antavan mahdollisuuden soveltaa oomykeetteihin lähestymistapoja, jotka on kehitetty korkeampien eukaryoottien populaatioiden tutkimiseen (panmixian ja populaatioiden jakautumisen analyysi, sisäiset ja populaatioiden geenivirrat jne.). Kolme tekijää eivät kuitenkaan salli näiden lähestymistapojen täydellistä siirtämistä P. infestans -populaatioita tutkittaessa.
1. Hybridi-oosporien ohella populaatioissa muodostuu itsensä hedelmällisiä ja partenogeneettisiä oosporeja (Fife ja Shaw, 1992; Anikina et ai., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003), ja niiden muodostumisen tiheys voi olla riittävä vaikuttamaan testituloksista.
2. P. infestans -lajin sukupuoliprosessilla on merkityksetön vaikutus populaation koon dynamiikkaan, koska sieni lisääntyy pääasiassa vegetatiivisilla itiöillä, muodostaen yli 90% parittelutyypin analyysin tuloksista perinteisellä menetelmällä ravintoalustalla ... kasvukausi on usean sukupolven aseksuaalinen itiöinti (polysyklisen taudin kehitys). Oosporilla on tärkeä rooli organismin säilymisessä aikana, jolloin vihreitä kasveja ei ole (talvella), ja taimien ensisijaisessa tartunnassa. Sitten kesän aikana tapahtuu klonaalista lisääntymistä ja seksuaalisen yhdistämisen seurauksena syntyneiden yksittäisten kloonien määrän lisääntymistä tai päinvastoin vähenemistä, mikä määräytyy pääasiassa mukautuneiden valinnan mukaan. Siksi yksittäisten kloonien suhde populaatiossa epifytoosien alussa ja lopussa voi olla täysin erilainen.
3. Kuvattu sykli on ominaista P. infestansin alkuperäiskansoille heidän kotimaassaan, Keski-Amerikassa. Muualla maailmassa seksuaalinen prosessi ei ollut tiedossa yli 100 vuoden ajan; tartunnan saaneiden perunan mukuloiden vegetatiivinen myseeli oli talvehtimisvaihe. Elinkaari oli täysin ketterä, ja leviäminen oli luonteeltaan keskitetysti: yksittäisten tartunnan saaneiden istutettujen mukuloiden tartunta siirtyi lehtiin muodostaen taudin ensisijaiset polttopisteet, jotka saattoivat sulautua taudin massiivisen kehityksen aikana.
Joten joillakin alueilla voi olla vuorovaikutusta seksuaalisten ja aseksuaalisten syklien kanssa, kun taas toisilla - vain aseksuaalinen sykli.
P. INFESTANS: n alkuperä
P. infestans ilmestyi Eurooppaan 1991-luvun alkupuoliskon lopussa. Koska peruna on kotoisin Etelä-Amerikan koillisosasta, oletettiin, että loinen tuotiin sieltä Eurooppaan Chilen suolapeiton puomin aikana. Meksikossa Tolucan laaksossa Rockefeller Centerin peruna-asemalla tehdyt tutkimukset pakottivat tämän näkemyksen tarkistamaan (Niederhauser 1993, XNUMX).
1. Toluca-laaksossa paikallisilla mukulaperunalajeilla (Solanum demissum, S. bulbocastanum jne.) On erilaisia vertikaalisen resistenssin geenisarjoja yhdistettynä korkeaan epäspesifiseen resistenssiin, mikä viittaa pitkään evoluutioon loisen kanssa. Etelä-Amerikan lajeilla, myös sadonperunoilla, ei ole resistenssigeenejä.
2. Toluca-laaksossa on isolaatteja, joiden parittelutyyppi on A1 ja A2, minkä seurauksena P. infestansin risteytynyt populaatio on laajalle levinnyt; Viljeltyjen perunoiden kotimaassa Etelä-Amerikassa loinen leviää kloonisesti.
3. Tolucan laaksossa esiintyy vuosittain vakavia myöhäisrokotuksen epidemioita. Siksi pohjoisamerikkalaisten tutkijoiden (Cornell University) keskuudessa vakiintuu mielipide Mesoamericasta (Keski-Amerikka) perunan fytophthoran syntymäpaikasta (Goodwin et al., 1994).
Etelä-Amerikan tutkijat eivät ole samaa mieltä. He uskovat, että viljellyllä perunalla ja sen loisilla P. infestansilla on yhteinen kotimaa - Etelä-Amerikan Andit. He tukivat näkemystään molekyylitutkimuksilla mitokondrioiden genomin (mtDNA) sekä ydingeenien RAS ja β-tubuliini DNA-polymorfismien analysoimiseksi (Gomez-Alpizar et ai., 2007). Ne osoittivat, että eri puolilta maailmaa kerätyt kannat polveutuivat kolmesta toisistaan poikkeavasta esi-isälinjasta, jotka (kaikki kolme) löytyvät Etelä-Amerikan Andeista. Andien haplotyypit ovat kahden linjan jälkeläisiä: vanhimpien mtDNA-suvun isolaatit löytyvät luonnonvaraisista Solanaceae-eläimistä Ecuadorin Anarrhicomenum-osiosta, kun taas toisen linjan isolaatit ovat yleisiä perunoilla, tomaateilla ja luonnonvaraisilla yökerhoilla. Tolucassa jopa harvinaiset haplotyypit polveutuvat vain yhdestä suvusta, ja Toluca-kantojen geneettinen vaihtelu (joidenkin muuttuvien alueiden alhainen alleelitiheys) viittaa vahvaan perustajavaikutukseen viimeaikaisen ajautumisen vuoksi.
Lisäksi Andeista löydettiin uusi P. andina -laji, morfologisesti ja geneettisesti samanlainen kuin P. infestans, joka kirjoittajien mukaan viittaa Andeihin Phytophthora-suvun spesifikaation kuumana paikkana. Lopuksi Euroopassa ja Yhdysvalloissa P. Infestansin populaatiot sisältävät molemmat Andien sukut, kun taas Tolucassa vain yksi.
Tämä julkaisu sai vastauksen ryhmältä tutkijoita eri maista, jotka tekivät paljon kokeellista työtä edellisen tutkimuksen tarkistamiseksi (Goss et al., 2014). Tässä työssä käytettiin ensinnäkin informatiivisempia mikrosatelliitti-DNA-sekvenssejä DNA-polymorfismien tutkimiseen; toiseksi klusteroitumisen, muuttoreittien, populaatioiden erilaistumisajan jne. analysoimiseksi käytettiin edistyneempiä malleja (F-tilastot, Bayesin likiarvot jne.) ja kolmanneksi vertailua ei käytetty vain Andien P. andina -lajin kanssa, jossa todettiin hybridiluonto (P. infestans x Phytophthora sp. , mutta myös Meksikon endeemisten lajien P. mirabilis, P. Ipomoeae ja Phytophthora phaseoli - geneettisesti läheiset P. infestans, jotka kuuluvat samaan ryhmään (Kroon et al., 2012). Näiden analyysien tuloksena osoitettiin yksiselitteisesti, että kaikkien tutkimukseen otettujen Phytophthora-suvun lajien filogeneettisen puun juuriosa, lukuun ottamatta P. andina -hybridiä, kuuluu Meksikon kantoihin, ja muuttovirralla on suunta Meksiko - Andit eikä päinvastoin, ja sen alku osuu Euroopan Uuden maailman asuttaminen (300-600 vuotta sitten). Täten perunoiden hävittämiseen erikoistuneiden P. infestans -lajien esiintyminen tapahtui mukulan solanaceae-muodostumisen sekundäärisessä geneettisessä keskuksessa, so. Keski-Amerikassa.
P. INFESTANSin genomi
Vuonna 2009 kansainvälinen tutkijaryhmä sekvensoi täydellisen P-infestaanin genomin (Haas et al., 2009), jonka koko oli 240 Mt. Tämä on useita kertoja enemmän kuin läheisissä sukulaislajeissa P. sojae (95 Mb), jotka aiheuttavat soijapapujen juurimätää, ja P. Ramorum (65 Mb), jotka vaikuttavat sellaisiin arvokkaisiin puulajeihin kuin tammi, pyökki ja jotkut muut. Saadut tiedot osoittivat, että genomi sisältää suuren määrän toistettujen sekvenssien kopioita - 74%. Genomi sisältää 17797 proteiinia koodaavaa geeniä, joista suurin osa on geenejä, jotka osallistuvat soluprosesseihin, mukaan lukien DNA: n replikaatio, proteiinien transkriptio ja translaatio.
Phytophthora-suvun genomien vertailu paljasti epätavallisen genomiorganisaation, joka koostui konservoituneiden geenien sekvenssilohkoista, joissa geenitiheys on suhteellisen korkea ja toistuvien sekvenssien sisältö on suhteellisen alhainen, ja yksittäisillä alueilla, joilla ei ole konservoituneita geenisekvenssejä, joilla on alhainen geenitiheys ja suuri toistuvien alueiden pitoisuus. Konservatiivisten lohkojen osuus kaikista P. infestans -proteiinia koodaavista geeneistä on 70% (12440). Konservatiivisissa lohkoissa geenit ovat yleensä lähellä toisistaan keskimääräisen geenien välisen etäisyyden ollessa 604 emäsparia. Konservatiivisten lohkojen välisellä alueella intergeeninen etäisyys on suurempi (3700 bp) toistuvien elementtien tiheyden lisääntymisen vuoksi. Nopeasti kehittyvät efektorisekretorigeenit sijaitsevat geeniköyhillä alueilla.
P. Infestans -genomin sekvenssianalyysi osoitti, että noin kolmasosa genomista kuuluu siirrettäviin elementteihin. P. infestans -genomi sisältää huomattavasti enemmän erilaisia transposoniperheitä kuin muut tunnetut genomit. Suurin osa P. infestans -transposoneista kuuluu mustalaisperheeseen.
P. infestans -genomissa on tunnistettu suuri määrä patogeneesiin osallistuvia spesifisiä geeniperheitä. Merkittävä osa niistä koodaa efektoriproteiineja, jotka muuttavat isäntäkasvien fysiologiaa ja edistävät sen infektiota. Ne kuuluvat kahteen laajaan luokkaan: apoplastiset efektorit, jotka vaikuttavat solujen välisiin tiloihin (apoplastit), ja sytoplasmiset efektorit, jotka saapuvat soluihin haustorian kautta. Apoplastisiin efektoreihin kuuluvat erittyvät hydrolyyttiset entsyymit, kuten proteaasit, lipaasit ja glykosylaasit, jotka tuhoavat kasvisoluja; isäntäkasvien puolustusentsyymien estäjät ja nekrotisoivat toksiinit, kuten Nep1: n kaltaiset proteiinit (NPL) ja Pcf: n kaltaiset pienet kysteiinipitoiset proteiinit (SCR).
P. infestans -efektorigeenit ovat lukuisia ja yleensä suurempia kuin ei-patogeeniset geenit. Tunnetuimpia ovat sytoplasman efektorit RXLR ja Crinkler (CNR). Oomykeettien tyypilliset sytoplasman efektorit ovat RXLR-proteiinit. Kaikki tähän mennessä löydetyt RXLR-efektorigeenit sisältävät aminoterminaalisen ryhmän Arg-XLeu-Arg, jossa X on aminohappo. Tutkimuksen tuloksena ehdotettiin, että P. infestans -genomissa on 563 RXLR-geeniä, mikä on 60% enemmän kuin P. sojaessa ja P. ramorumissa. Noin puolet P. infestans -geenin RXLR-geeneistä on lajikohtaisia. RXLR-efektoreilla on laaja valikoima sekvenssejä. Heistä tunnistettiin yksi suuri ja 150 pientä perhettä. Toisin kuin pääproteomi, RXLR-efektorigeenit sijaitsevat yleensä genomin köyhillä ja toistuvasti rikkailla alueilla. Näiden alueiden dynamiikan määrittävät liikkuvat elementit edistävät rekombinaatiota näissä geeneissä.
Sytoplasman CRN-efektorit tunnistettiin alun perin P. infestans -transkripteissa, jotka koodaavat kasvikudoksen nekroosipeptidejä. Heidän löytöstään lähtien näiden efektoreiden perheestä on tiedetty vähän. P. Infestans -genomin analyysi paljasti valtavan 196 CRN-geeniperheen, joka on merkittävästi suurempi kuin P. sojaessa (100 CRN) ja P. ramorum (19 CRN). Kuten RXLR: t, CRN: t ovat modulaarisia proteiineja ja koostuvat erittäin konservoituneesta N-terminaalisesta LFLAK-domeenista (50 aminohappoa) ja vierekkäisestä DWL-domeenista, joka sisältää erilaisia geenejä. Suurimmalla osalla CRN: itä (60%) on signaalipeptidi.
Eri CRN: ien mahdollisuutta häiritä isäntäkasvien soluprosesseja on tutkittu. Kasvien nekroosia analysoitaessa CRN2-proteiinien poistaminen mahdollisti 234 aminohaposta (asemat 173-407, DXG-domeeni) koostuvan ja solukuoleman aiheuttavan C-terminaalisen alueen tunnistamisen. P. infestans CRN -geenien analyysi paljasti neljä erilaista C-terminaalista aluetta, jotka myös aiheuttavat solukuoleman kasvissa. Näihin kuuluvat äskettäin tunnistetut DC-domeenit (P. Infestansilla on 18 geeniä ja 49 pseudogeeniä), samoin kuin D2 (14 ja 43) ja DBF (2 ja 1) domeenit, jotka ovat samanlaisia kuin proteiinikinaasit. Kasvissa ilmentyvät CRN-domeenien proteiinit konservoituvat (signaalipeptidien puuttuessa) kasvisolussa ja stimuloivat solukuolemaa solunsisäisellä mekanismilla. Toinen 255 CRN-domeeneja sisältävä sekvenssi ei todennäköisesti toimi geeneinä.
RXLR- ja CRN-efektorigeeniperheiden lukumäärän ja koon kasvu johtui oletettavasti ei-alleelisesta homologisesta rekombinaatiosta ja geenin kaksoiskappaleista. Huolimatta siitä, että genomissa on suuri määrä aktiivisia liikkuvia elementtejä, ei ole silti suoraa näyttöä efektorigeenien siirtymisestä.
Väestörakenteen tutkimuksessa käytetyt menetelmät
Populaatioiden geneettisen rakenteen tutkimus perustuu tällä hetkellä sen muodostavien kantojen puhtaiden viljelmien analyysiin. Populaatioiden analyysi eristämättä puhtaita viljelmiä suoritetaan myös erityistarkoituksiin, kuten esimerkiksi populaation aggressiivisuuden tai sienitautien vastustuskykyisten kantojen tutkiminen siinä (Filippov et al., 2004; Derevyagina et al., 1999). Tämän tyyppiseen tutkimukseen liittyy erityisten menetelmien käyttö, joiden kuvaus on tämän tarkastelun ulkopuolella. Kantojen vertailevaan analyysiin käytetään useita menetelmiä, jotka perustuvat sekä DNA-rakenteen analyysiin että fenotyyppisten ilmenemismuotojen tutkimiseen. Populaatioiden vertailevassa analyysissä on käsiteltävä suurta määrää isolaatteja, mikä asettaa tietyt vaatimukset käytetyille menetelmille. Ihannetapauksessa heidän tulisi täyttää seuraavat vaatimukset (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- oltava halpa, helppo toteuttaa, ei vaadi merkittäviä ajankulutuksia, perustuttava yleisesti saatavilla olevaan tekniikkaan (esimerkiksi PCR)
- sen on tuotettava riittävän suuri määrä riippumattomia koodominanttimerkkijärjestelmiä;
- joilla on korkea toistettavuus
- käytä tutkittavan kudoksen vähimmäismäärä
- oltava spesifinen substraatille (viljelmässä oleva epäpuhtaus ei saisi vaikuttaa tuloksiin);
- eivät vaadi vaarallisten menettelyjen ja erittäin myrkyllisten kemikaalien käyttöä.
Valitettavasti kaikkia edellä mainittuja parametreja vastaavia menetelmiä ei ole. Vertailevaan tutkimukseen aikamme kannoista käytetään menetelmiä, jotka perustuvat fenotyyppisten ominaisuuksien analyysiin: virulenssi peruna- ja tomaattilajikkeisiin (peruna- ja tomaattikilpailut), parittelutyyppi, peptidaasi-isoentsyymien ja glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasin spektrit ja DNA-rakenteen analyysiin: pituuspolymorfismi restriktiofragmentti (RFLP), jota yleensä täydennetään hybridisaatiokoettimella RG 57, mikrosatelliittitoistojen analyysi (SSR ja InterSSR), amplifikaatio satunnaisalukkeilla (RAPD), restriktiofragmenttien amplifikaatio (AFLP), monistus alukkeilla, jotka ovat homologisia liikkuvien elementtien sekvenssien kanssa (esimerkiksi Inter SINE PCR), mitokondrioiden DNA-haplotyyppien määrittäminen.
Lyhyt kuvaus P. Infestansin kanssa työskenneltyjen kantojen vertailevan tutkimuksen menetelmistä
Fenotyyppiset merkkiaineet
"Peruna" -kilpailut
"Peruna" rodut ovat yleisesti tutkittu ja käytetty merkki. Yksinkertaisilla perunarotuilla on yksi perunavirulenssigeeni, "monimutkaisilla" - vähintään kaksi. Black et ai. (1953), yhteenvetona kaikista heidän käytettävissä olevista tiedoistaan, havaitsi, että phytophthora-rotu kykenee tartuttamaan kasvit P. infestans virulence -geeniä / -geenejä vastaavilla resistenssigeeneillä / geeneillä, ja löysi rodut 1, 2, 3 ja 4, jotka infektoivat kasveja geenien R1, R2, R3 ja R4 kanssa, so. loisen ja isännän välinen vuorovaikutus tapahtuu geenigeeniperiaatteen mukaisesti. Lisäksi Black löysi Galleglyn ja Malcolmsonin osallistuessa resistenssigeenit R5, R6, R7, R8, R9, R10 ja R11 sekä vastaavat rodut (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Eri alueiden taudinaiheuttajan rodullisesta koostumuksesta on laaja joukko tietoja. Analysoimatta näitä tietoja yksityiskohtaisesti, ilmoitamme vain yleisen suuntauksen: missä käytettiin lajikkeita, joilla oli uusia resistenssigeenejä tai niiden yhdistelmiä, aluksi myöhäisrokotus heikkeni, mutta sitten kilpailut vastaavien virulenssigeenien kanssa ilmestyivät ja valittiin ja myöhästyneen taudin puhkeaminen jatkui. Spesifistä virulenssia neljää ensimmäistä resistenssigeeniä (R4-R1) vastaan havaittiin harvoin kokoelmissa, jotka kerättiin ennen näiden geenien sisältämien lajikkeiden viljelyyn aloittamista, mutta virulenttisten kantojen määrä kasvoi voimakkaasti, kun taudinaiheuttaja loissi näitä geenejä kantavissa lajikkeissa. Geenit 4-5 puolestaan olivat melko yleisiä kokoelmissa (Shaw, 11).
Kasvukauden aikana tehtyjen eri rotujen suhdetta koskeva tutkimus, joka tehtiin 1980-luvun lopulla, osoitti, että taudin kehittymisen alussa populaatiossa vallitsevat kloonit, joilla on vähän aggressiivisuutta ja 1-2 virulenssigeeniä.
Lisäksi myöhästyneen taudin kehittymisen myötä alkuperäisten kloonien pitoisuus pienenee ja "monimutkaisten" kilpailujen määrä, joilla on suuri aggressiivisuus, kasvaa. Jälkimmäisen esiintyminen kauden loppuun mennessä saavuttaa 100%. Mukuloita varastoitaessa aggressiivisuus ja yksittäisten virulenssigeenien menetys vähenevät. Kloonikorvauksen dynamiikka voi esiintyä eri muunnoksissa eri tavoin (Rybakova & Dyakov, 1990). Vuosina 2000-2010 tehdyt tutkimuksemme kuitenkin osoittivat, että monimutkaisia rotuja löytyy epifytoosien alusta alkaen sekä perunoista että tomaateista eristettyjen kantojen joukossa. Tämä johtuu todennäköisesti muutoksesta P. Infestansin populaatioissa Venäjällä.
Vuosiin 1988-1995 mennessä "superrotujen" esiintyminen kaikilla tai melkein kaikilla virulenssigeeneillä eri alueilla saavutti 70-100%. Tämä tilanne havaittiin esimerkiksi Valko-Venäjällä, Leningradin ja Moskovan alueilla, Pohjois-Ossetiassa ja Saksassa (Ivanyuk et ai., 2002a, 2002b; Polityko, 1994; Schober-Butin ym., 1995).
"Tomaatti" -kilpailut
Tomaattilajikkeista löydettiin vain 2 geeniä, jotka ovat vastustuskykyisiä myöhäisrokotukselle - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) ja Ph2 (Al-Kherb, 1988). Kuten perunarotujen tapauksessa, tomaattien ja P. infestansin vuorovaikutus tapahtuu geenikohtaisesti. T0-rotu tartuttaa lajikkeet, joilla ei ole resistenssigeenejä (suurin osa teollisesti käytetyistä lajikkeista), T1-rotu tartuttaa lajikkeet Ph1-geenillä (Ottawa) ja T2-rotu infektoi lajikkeet Ph2-geenillä.
Venäjällä lähes yksinomaan T0: ta löydettiin perunoista; T0 hallitsi tomaatteja kauden alussa, mutta myöhemmin se korvattiin T1-kilpailulla (Dyakov et al., 1975, 1994). Vuoden 2000 jälkeen T1-perunoita monissa populaatioissa alkoi esiintyä epifytoottisen jakson alussa. Yhdysvalloissa perunakannat eivät olleet patogeenisiä tomaatille, samoin kuin rodut T0, T1 ja T2, kun taas T1 ja T2 olivat hallitsevia tomaateissa (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et ai., 1995).
Parittelutyyppi
Tutkimuksen suorittamiseksi tarvitaan testaaja (vertailukannat), joilla on tunnetut parittelutyypit - A1 ja A2. Koeisolaatti siirrostetaan niiden kanssa pareittain Petri-maljoille kauran agar-väliaineella. 10 päivän inkuboinnin jälkeen maljoille tutkitaan oosporien läsnäolo tai puuttuminen kantojen kosketusvyöhykkeellä olevasta väliaineesta. Vaihtoehtoja on 4: kanta kuuluu A1-parittelutyyppiin, jos se muodostaa oosporeja A2-testaajan kanssa, A2: een, jos se muodostaa oosporeja A1-testaajan kanssa, A1A2: een, jos se muodostaa oosporeja molempien testaajien kanssa tai on steriili (00), jos se ei muodosta oosporeja ilman testaajaa (kaksi viimeistä ryhmää ovat harvinaisia).
Parittelutyyppien määrittämiseksi nopeammin yritettiin tunnistaa parittelutyyppiin liittyvät genomin alueet, tarkoituksena niiden jatkojalostus parittelutyypin määrittämiseksi PCR: llä. Amerikkalaiset tutkijat tekivät yhden ensimmäisistä onnistuneista kokeista tällaisen paikan tunnistamiseksi (Judelson et al., 1995). RAPD-menetelmää käyttäen he pystyivät tunnistamaan parittelutyyppiin liittyvän W16-alueen kahden ristitetyn isolaatin jälkeläisissä ja suunnittelemaan parin 24 bp aluketta sen monistamiseksi (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') ja W16-2 (5') -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Kun PCR-tuote oli restriktio restriktioentsyymillä HaeIII, oli mahdollista erottaa isolaatit pariliitostyypeillä A1 ja A2.
Korealaiset tutkijat yrittivät toisen kerran saada PCR-markkereita parittelutyyppien määrittämiseksi (Kim, Lee, 2002). He tunnistivat tietyt tuotteet AFLP-menetelmällä. Tuloksena kehitettiin alukepari PHYB-1 (eteenpäin) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') ja PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), mikä mahdollisti A2-parittelutyyppiin liittyvän genomialueen valikoivan vahvistamisen. Myöhemmin he jatkoivat tätä työtä ja suunnittelivat alukkeet 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, eteenpäin) ja 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), jotka mahdollistivat mat-A1-alueen selektiivisen monistamisen parittelutyypille. A1. Parittelutyyppien PCR-diagnostiikan käyttö osoitti hyviä tuloksia tutkittaessa P. infestans -populaatioita Tšekin tasavallassa (Mazakova et al., 2006), Tunisiassa (Jmour, Hamada, 2006) ja muilla alueilla. Laboratoriossamme (Mytsa, Elansky, julkaisematon) analysoitiin 34 P. infestans -kantaa, jotka oli eristetty sairaista peruna- ja tomaattielimistä Venäjän eri alueilla (Kostroma, Ryazan, Astrakhan ja Moskovan alueet). PCR-analyysin tulokset, joissa käytettiin spesifisiä alukkeita yli 90%, osuivat yhteen parittelutyypin analyysin tulosten kanssa perinteisellä menetelmällä ravintoalustalla.
Taulukko 1. Resistenssin vaihtelu Sib 1 -kloonissa (Elansky et ai., 2001)
Näytteenottopaikka | Analysoitujen isolaattien lukumäärä | Herkkien (S), heikosti resistenttien (SR) ja resistenttien (R) kantojen lukumäärä, kpl (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnojarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Jekaterinburgin kaupunki | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sakhalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Omskin alue | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Metalaksyyliresistenssi populaatiomarkkerina
1980-luvun alussa metalaksyyliresistenttien P. infestans -kantojen aiheuttamia voimakkaita myöhästyneen taudinpurkauksia havaittiin useilla alueilla. Monien maiden perunatilat ovat kärsineet merkittäviä tappioita (Dowley & O'Sullivan, 1981; Davidse et ai., 1983; Derevyagina, 1991). Siitä lähtien monissa maailman maissa fenyyliamidiresistenttien kantojen esiintymistä P. infestans -populaatioissa on seurattu jatkuvasti. Fenyyliamidia sisältävien lääkkeiden käytön mahdollisuuksien käytännön arvioinnin, suojatoimenpiteiden järjestelmän rakentamisen ja epifytottien ennustamisen lisäksi resistenssistä näille lääkkeille on tullut yksi merkittävistä ominaisuuksista, joita käytetään laajalti tämän patogeenin populaatioiden vertailevassa analyysissä. Metalaksyyliresistenssin käyttö vertailevissa populaatiotutkimuksissa tulisi kuitenkin ottaa huomioon, että: 1 - resistenssin geneettistä perustaa ei ole vielä määritelty tarkasti, 2 - metalaksyyliresistenssi on valikoivasti riippuva piirre, joka voi muuttua fenyyliamidien käytöstä riippuen, 3 - erilainen herkkyys metallaksyylikannoille yhdellä klonaalisella viivalla (taulukko 1).
Isotsyymien spektrit
Isotsyymimarkkerit ovat yleensä riippumattomia ulkoisista olosuhteista, osoittavat Mendelin perintöä ja ovat koodominantteja, jolloin homo- ja heterotsygootit voidaan erottaa toisistaan. Proteiinien käyttö geenimarkkereina antaa mahdollisuuden tunnistaa sekä geneettisen materiaalin suuret uudelleenjärjestelyt, mukaan lukien kromosomaaliset ja genomiset mutaatiot, että yksittäisten aminohappojen substituutiot.
Proteiinien elektroforeettiset tutkimukset ovat osoittaneet, että useimmat entsyymit esiintyvät organismeissa useiden fraktioiden muodossa, jotka eroavat toisistaan elektroforeettisessa liikkuvuudessa. Nämä jakeet ovat seurausta useiden entsyymimuotojen koodaamisesta eri lokuksilla (isotsyymit tai isotsyymit) tai saman lokuksen eri alleeleilla (allotsyymit tai alloentsyymit). Toisin sanoen isotsyymit ovat yhden entsyymin eri muotoja. Eri muodoilla on sama katalyyttinen aktiivisuus, mutta ne eroavat toisistaan hieman peptidin yksittäisissä aminohapposubstituutioissa ja vastuussa. Tällaiset erot paljastuvat elektroforeesin aikana.
P. infestans -kantoja tutkittaessa käytetään kahden proteiinin, peptidaasin ja glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasin, isoentsyymien spektrejä (tämä entsyymi on monomorfinen Venäjän populaatioissa; siksi sen tutkimismenetelmiä ei esitetä tässä työssä). Niiden erottamiseksi isotsyymeiksi sähkökentässä tutkituista organismeista eristetyt proteiinivalmisteet levitetään geelilevylle, joka on asetettu sähkökenttään. Yksittäisten proteiinien diffuusionopeus geelissä riippuu varauksesta ja molekyylipainosta; siksi proteiiniseos erotetaan sähkökentässä erillisiksi jakeiksi, jotka voidaan visualisoida käyttämällä erityisiä väriaineita.
Peptidaasi-isoentsyymien tutkimus suoritetaan selluloosa-asetaatti-, tärkkelys- tai polyakryyliamidigeeleillä. Kätevin on Helena Laboratories Inc. -yhtiön valmistamien selluloosa-asetaattigeelien käyttöön perustuva menetelmä. Se ei vaadi suuria määriä testimateriaaleja, sen avulla voidaan saada kontrastivyöhykkeitä geelille elektroforeesin jälkeen molemmille entsyymilokeille, sen toteuttaminen ei vaadi suuria aika- ja materiaalikustannuksia (kuva 2).
Pieni myseeli pala siirretään 1,5 ml: n mikroputkeen, siihen lisätään 1-2 tippaa tislattua vettä. Sen jälkeen näyte homogenisoidaan (esimerkiksi sähköporalla, jossa on mikroputkeen sopiva muovinen kiinnitys) ja sedimentoidaan 25 sekunnin ajan sentrifugissa 13000 rpm: llä. 8 μl kustakin mikroputkesta. supernatantti siirretään applikaattorilevylle.
Selluloosa-asetaattigeeli poistetaan puskurisäiliöstä, pyyhitään kahden suodatinpaperiarkin väliin ja asetetaan työkerros applikaattorin muovipohjan päälle. Levitin siirretään levyltä levylle geeliin 2-4 kertaa. Geeli siirretään elektroforeesikammioon,
Taulukko 2. Selluloosa-asetaattigeelin värjäämiseen käytetyn liuoksen koostumus peptidaasi-isoentsyymien analyysissä, pisara maalia (bromifenolisininen) asetetaan geelin reunalle.
TRIS HCI, 0,05 M, Ph 8,0 2 ml
Peroksidaasi, 1000 U / ml, 5 tippaa
o-dianisidiini, 4 mg / ml 8 tippaa
MgCl2, 20 mg / ml 2 tippaa
Gly-Leu, 15 mg / ml, 10 tippaa
L-aminohappooksidaasi, 20 yksikköä / ml 2 tippaa
Elektroforeesi suoritetaan 20 minuutin ajan. Elektroforeesin jälkeen geeli siirretään maalauspöydälle ja maalataan erityisellä maaliliuoksella (taulukko 200). 2 ml 10-prosenttista DIFCO-agaria sulatetaan alustavasti mikroaaltouunissa, jäähdytetään 1,6 ° C: seen, minkä jälkeen 60 ml agaria sekoitetaan maaliseoksen kanssa ja kaadetaan geelille. Raidat ilmestyvät 2-15 minuutin kuluessa. L-aminohappooksidaasireagenssi lisätään välittömästi ennen liuoksen sekoittamista sulaan agariin.
Venäjän populaatioissa Pep 1 -aluetta edustavat genotyypit 100/100 ja 92/100. Homotsygootti 92/92 on erittäin harvinaista (noin 0,1%). Locus Rehr 2: ta edustaa kolme genotyyppiä 100/100, 100/112 ja 112/112, ja kaikki 3 muunnosta ovat melko yleisiä (Elanky ja Smirnov, 2003, kuva 2).
Genomitutkimus
Rajoitusfragmentin pituuden polymorfismi ja seuraava hybridisaatio (RFLP-RG 57)
Kokonais-DNA: ta käsitellään EcoRI-restriktioentsyymillä, DNA-fragmentit erotetaan elektroforeesilla agaroosigeelissä. Ydin-DNA on erittäin suuri ja siinä on useita toistuvia sekvenssejä, mikä vaikeuttaa restriktioentsyymien vaikutuksesta saatujen lukuisten fragmenttien suoraa analysointia. Siksi geelissä erotetut DNA-fragmentit siirretään erityiseen kalvoon ja käytetään hybridisaatioon RG 1-koettimen kanssa, joka sisältää radioaktiivisilla tai fluoresoivilla leimoilla leimatut nukleotidit. Tämä koetin hybridisoituu toistuvien genomisekvenssien kanssa (Goodwin et ai., 57, Forbes et ai., 1992). Kun valon tai radioaktiivisen materiaalin hybridisaatiotulokset on visualisoitu, saadaan monilokinen hybridisaatioprofiili (sormenjälkien ottaminen), jota edustaa 1998-25 fragmenttia (Forbes et ai., 29). Seksuaalisilla (klonaalisilla) jälkeläisillä on samat profiilit. Kaistojen järjestely elektroforetogrammilla arvioidaan vertailtujen organismien yhtäläisyydet ja erot.
Mitokondrioiden DNA-haplotyypit
Useimmissa eukaryoottisoluissa mtDNA on kaksisäikeinen pyöreä DNA-molekyyli, joka, toisin kuin eukaryoottisolujen ydinkromosomit, replikoituu puolikonservatiivisesti eikä ole yhteydessä proteiinimolekyyleihin.
P. infestansin mitokondrioiden genomi sekvensoitiin, ja useita teoksia omistettiin restriktiofragmenttien pituuksien analysoinnille (Carter et ai., 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Kun Griffith ja Shaw (1998) ovat kehittäneet yksinkertaisen ja nopean menetelmän mtDNA-haplotyyppien määrittämiseksi, tästä merkistä tuli yksi suosituimmista P. Infestans -tutkimuksissa. Menetelmän ydin koostuu kahden mitokondrioiden DNA-fragmentin (yhteisestä genomista) peräkkäisestä monistamisesta alukkeilla F2-R2 ja F4-R4 (taulukko 3) ja niiden myöhempi restriktio restriktioentsyymeillä MspI (1. fragmentti) ja EcoR1 (2. fragmentti). Menetelmän avulla voit tunnistaa 4 haplotyyppiä: Ia, IIa, Ib, IIb. Tyyppi II eroaa tyypistä I 1881 bp: n insertin läsnäololla ja eri restriktiokohtien sijainnilla P2- ja P4-alueilla (kuvio 3).
Vuodesta 1996 Venäjän alueella kerättyjen kantojen joukossa havaittiin vain haplotyypit Ia ja IIa (Elansky et ai., 2001, 2015). Ne voidaan tunnistaa sen jälkeen, kun restriktiotuotteet on erotettu alukkeella F2-R2 sähkökentässä (kuvat 4, 5). MtDNA-tyyppejä käytetään kantojen ja populaatioiden vertailevassa analyysissä. Useissa teoksissa mitokondrioiden DNA-tyyppejä käytettiin klonaalisten viivojen eristämiseen ja P. infestans -isolaattien kuljettamiseen (Botez et ai., 2007; Shein et ai., 2009). Käyttämällä PCR-RFLP-menetelmää pääteltiin, että mtDNA on heterogeeninen samassa P. infestans -kannassa (Elansky ja Milyutina, 2007). Monistusolosuhteet: 1x (500 s. 94 ° C), 40x (30 s. 90 ° C, 30 s. 52 ° C, 90 s. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Reaktioseos: (20 μl): 0,2 U Taq-DNA-polymeraasi, 1x 2,5 mM MgCl2-Taq-puskuri, 0,2 mM kukin dNTP, 30 pM aluke ja 5 ng analysoitua DNA: ta, deionisoitu vesi - 20 μl asti.
PCR-tuotteen rajoittaminen suoritetaan 4-6 tunnin ajan 37 ° C: n lämpötilassa. Rajoitusseos (20 μl): 10x MspI (2 μl), 10x restriktiopuskuri (2 μl), deionisoitu vesi (6 μl), PCR-tuote (10 μl).
Taulukko 3. MtDNA-polymorfisten alueiden monistamiseen käytetyt alukkeet
Locus | pohjamaali | Pohjusteen pituus ja sijoitus | PCR-tuotteen pituus | Rajoitus |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21 13619; 13639-XNUMX | 1070 | Spsp |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22 14688; 14667-XNUMX | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22 9329; 9350-XNUMX | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22 10292; 10271-XNUMX |
Satunnainen alukeamplifikaatio (RAPD)
RAPD: tä suoritettaessa käytetään yhtä aluketta (joskus useita alukkeita samanaikaisesti) mielivaltaisen, yleensä 10 nukleotidin pituisen nukleotidisekvenssin kanssa, jolla on korkea (noin 50%) GC-nukleotidien pitoisuus ja alhainen hehkutuslämpötila (noin 35 ° C). Tällaiset alukkeet "laskeutuvat" genomin lukuisille täydentäville alueille. Monistamisen jälkeen saadaan suuri määrä amplikoneja. Niiden määrä riippuu käytetystä alukkeesta (alukkeista) ja reaktio-olosuhteista (MgCl2-konsentraatio ja hehkutuslämpötila).
Amplikonien visualisointi suoritetaan tislaamalla polyakryyliamidissa tai agaroosigeelissä. RAPD-analyysiä suoritettaessa on tarpeen seurata tarkkaan analysoidun materiaalin puhtautta, koska kontaminaatio muilla elävillä esineillä voi aiheuttaa huomattavan määrän artefaktien lisääntymistä, joita on melko paljon puhtaan materiaalin analyysissä (Perez et ai., 1998). Tämän menetelmän käyttö P. infestans -genomin tutkimuksessa heijastuu monissa teoksissa (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire et ai., 2002, Carlisle et ai., 2001). Reaktio-olosuhteiden ja alukkeiden valinta (tutkittiin 51 10-nukleotidialuketta) on annettu Abu-El Samen et ai., (2003) artikkelissa.
Mikrosatelliittitoisteanalyysi (SSR)
Mikrosatelliittitoistot (yksinkertaiset sekvenssitoistot, SSR) ovat kaikkien eukaryoottien ydingenomeissa läsnä olevien 1-3 (joskus jopa 6) nukleotidin lyhyitä sekvenssejä. Peräkkäisten toistojen määrä voi vaihdella 10: stä 100: een. Mikrosatelliittilokeja esiintyy melko suurella taajuudella ja ne ovat jakautuneet enemmän tai vähemmän tasaisesti koko genomiin (Lagercrantz et ai., 1993). Mikrosatelliittisekvenssien polymorfismi liittyy eroihin peruskuvion toistojen lukumäärässä. Mikrosatelliittimarkkerit ovat koodominantteja, mikä mahdollistaa niiden käytön analysoimaan populaatiorakennetta, määrittämään sukulaisuuksia, genotyyppien siirtymisreittejä jne. Näiden markkereiden muiden etujen joukossa on huomattava, että niillä on suuri polymorfismi, hyvä toistettavuus, neutraalisuus ja kyky suorittaa automaattinen analyysi ja arviointi. Aluksi analyysi suoritettiin erottamalla reaktiotuotteet polyakryyliamidigeelillä. Myöhemmin Applied Biosystems -yhtiön työntekijät ehdottivat fluoresoivasti leimattujen alukkeiden käyttöä reaktiotuotteiden havaitsemiseen käyttämällä automaattista lasertunnistinta (Diehl et ai., 1990) ja sitten tavanomaisia automaattisia DNA-sekvenssereitä (Ziegle et ai., 1992). Alukkeiden merkitseminen erilaisilla fluoresoivilla väreillä tekee mahdolliseksi analysoida useita markkereita kerralla yhdellä kaistalla ja vastaavasti lisätä merkittävästi menetelmän tuottavuutta ja lisätä analyysin tarkkuutta.
Ensimmäiset SSR-analyysin käyttöön P. infestans -tutkimukseen liittyvät julkaisut ilmestyivät 2000-luvun alussa. (Knapova, Gisi, 2002). Kaikki tekijöiden ehdottamat markkerit eivät osoittaneet riittävää polymorfismia, mutta kaksi niistä (4B ja G11) sisältyivät Lees et al. (12) ehdottamaan 2006 SSR-markkeriin ja otettiin sen jälkeen käyttöön Eucablight-tutkimusverkostossa (www.eucablight .org) vakiona P. infestansille. Muutama vuosi myöhemmin julkaistiin tutkimus P. infestans DNA: n multipleksianalyysijärjestelmän luomisesta kahdeksan SSR-markkerin perusteella (Li et ai., 2010). Lopuksi, arvioituaan kaikki aiemmin ehdotetut markkerit ja valitsemalla informatiivisimmat niistä, sekä optimoimalla alukkeet, fluoresoivat leimat ja monistusolosuhteet, sama tekijäryhmä esitteli yksivaiheisen multipleksianalyysin, mukaan lukien 12 markkeria (taulukko 4; Li et ai. , 2013a). Tässä järjestelmässä käytetyt alukkeet valittiin ja leimattiin yhdellä neljästä fluoresoivasta markkerista (FAM, VIC, NED, PET) niin, että samoilla leimoilla olevien alukkeiden alleelikokojen alueet eivät menneet päällekkäin.
Kirjoittajat suorittivat analyysin PTC200-vahvistimella (MJ Research, USA) käyttäen QIAGEN multiplex PCR -sarjoja tai QIAGEN Typeit Microsatellite PCR -sarjoja. Reaktioseoksen tilavuus oli 12.5 μl. Monistamisolosuhteet olivat seuraavat: QIAGEN multiplex PCR: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (60 s), 72 ° C (20 min); QIAGEN Type-it -mikrosatelliitti-PCR: lle: 95 ° C (5 min), 28x (95 ° C (30 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (20 s), 60 ° C (30 min).
PCR-tuotteiden erottaminen ja visualisointi suoritettiin käyttämällä automaattista ABI3730-kapillaari-DNA-analysaattoria (Applied Biosystems).
Taulukko 4. P. Infestansin genotyyppiin määrittämiseen käytettyjen 12 standardin SSR-markkerin ominaisuudet (Li et ai., 2013a)
Nimi | Alleelien lukumäärä | Kokovalikoima alleelit (bp) | Alukkeet |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
PI02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTCAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | FAM-TCTTGTTCGAGTATGGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
PI04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
PI70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
PI63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Esimerkki analyysitulosten visualisoinnista on esitetty kuviossa. 6. Tulokset analysoitiin käyttäen GeneMapper 3.7 -ohjelmistoa vertaamalla saatuja tietoja tunnettujen isolaattien tietoihin. Analyysitulosten tulkinnan helpottamiseksi on tarpeen sisällyttää kuhunkin tutkimukseen 1–2 referenssiisolaattia, joilla on tunnettu genotyyppi.
Ehdotettua tutkimusmenetelmää testattiin merkittävällä määrällä kenttänäytteitä, minkä jälkeen kirjoittajat standardoivat kahden organisaation, The James Hutton Institute (Iso-Britannia) ja Wageningen University & Research (Alankomaat) laboratorioiden väliset protokollat, jotka yhdessä mahdollisuuden käyttää vakiomaisia vapaakauppasopimuskortteja yksinkertaistettuihin P. infestansin DNA-näytteiden kerääminen ja lähettäminen mahdollisti puhumisen tämän kehityksen kaupallisesta käytöstä. Lisäksi nopea ja tarkka menetelmä P. infestans -isolaattien genotyyppien määrittämiseksi multipleksisen SSR-analyysin avulla mahdollisti standardisoitujen tutkimusten tekemisen tämän taudinaiheuttajan populaatioista maailmanlaajuisesti ja maailmanlaajuisen myöhäisrokotustietokannan luomisen Eucablight-projektin (www.eucablight.org) puitteissa. , mukaan lukien mikrosatelliittianalyysin tulokset, mahdollisti uusien genotyyppien syntymisen ja leviämisen seuraamisen ympäri maailmaa.
Monistettu restriktiofragmentin pituuden polymorfismi (AFLP). AFLP (amplifioitu fragmentin pituuden polymorfismi) on tekniikka satunnaisten molekyylimerkkien tuottamiseksi käyttämällä spesifisiä alukkeita. AFLP: ssä DNA: ta käsitellään kahden restriktioentsyymin yhdistelmällä. Spesifiset adapterit ligoidaan restriktiofragmenttien tahmeisiin päihin.
Nämä fragmentit monistetaan sitten käyttämällä alukkeita, jotka ovat komplementaarisia adapterisekvenssille ja restriktiokohdalle ja lisäksi kuljettavat yhtä tai useampaa satunnaista emästä niiden 3'-päissä. Saatu fragmenttijoukko riippuu restriktioentsyymeistä ja satunnaisesti valituista nukleotideista alukkeiden 3'-päässä (Vos et ai., 1995). AFLP - genotyypitystä käytetään nopeasti tutkimaan eri organismien geneettistä vaihtelua.
Yksityiskohtainen kuvaus menetelmästä on esitetty Muellerin, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul et ai., 1999 teoksissa. Kiinalaiset tutkijat ovat tehneet paljon työtä AFLP- ja SSR-menetelmien resoluution vertailemiseksi. Pohjois-Kiinan viideltä alueelta kerättyjen 48 P. infestans -isolaatin fenotyyppisiä ja genotyyppisiä ominaisuuksia tutkittiin. AFLP-spektrien perusteella tunnistettiin kahdeksan erilaista DNA-genotyyppiä, toisin kuin SSR-genotyypit, joiden monimuotoisuutta ei paljastettu (Guo et ai., 2008).
Monistaminen alukkeilla, jotka ovat homologisia liikkuvien elementtien sekvenssien kanssa
Retrotransposonien sekvensseistä johdetut markkerit ovat erittäin käteviä geneettiseen kartoitukseen, geneettisen monimuotoisuuden ja evoluutioprosessien tutkimiseen (Schulman, 2006). Jos alukkeet tehdään täydentämään tiettyjen liikkuvien elementtien stabiileja sekvenssejä, on mahdollista vahvistaa niiden välissä sijaitsevat genomialueet. Myöhäiskuolan aiheuttajan tutkimuksissa sovellettiin menestyksekkäästi menetelmää genomin osien monistamiseksi käyttäen aluketta, joka oli komplementaarinen SINE-retropatsonin ydinsekvenssille (Short Interspersed Nuclear Elements) (Lavrova ja Elansky, 2003). Tätä menetelmää käytettäessä paljastettiin eroja jopa yhden isolaatin sukupuolittomissa jälkeläisissä. Tältä osin pääteltiin, että SINE - PCR - menetelmä on erittäin spesifinen ja SINE - elementtien liikkumisnopeus Phytophthora - genomissa on korkea.
P. infestansin genomissa on tunnistettu 12 lyhyen retrotransposonin (SINE) perhettä; lyhyiden retrotransposonien lajijakaumaa tutkittiin; tunnistettiin vain P. infestansin genomissa olevat elementit (SINE) (Lavrova, 2004).
Kannan vertailevan tutkimuksen menetelmien soveltamisen piirteet populaatiotutkimuksissa
Tutkimusta suunniteltaessa on ymmärrettävä selvästi sen tavoitteet ja käytettävä asianmukaisia menetelmiä. Joten jotkut menetelmät mahdollistavat suuren määrän itsenäisten markkeriominaisuuksien muodostamisen, mutta samalla niiden toistettavuus on heikko ja riippuvat voimakkaasti käytetyistä reagensseista, reaktio-olosuhteista ja tutkittavan materiaalin saastumisesta. Siksi jokaisessa kantaryhmän tutkimuksessa on tarpeen käyttää useita standardi (vertailu) isolaatteja, mutta jopa tässä tapauksessa useiden kokeiden tuloksia on erittäin vaikea yhdistää.
Tähän ryhmään menetelmiä kuuluvat RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Monistamisen jälkeen saadaan suuri määrä erikokoisia DNA-fragmentteja. On suositeltavaa käyttää tällaisia tekniikoita, jos on tarpeen määrittää eroja läheisesti toisiinsa liittyvien kantojen välillä (vanhempien jälkeläiset, villityypin mutantit jne.) Tai tapauksissa, joissa tarvitaan pienen näytteen yksityiskohtainen analyysi. Näin ollen AFLP-menetelmää käytetään laajalti P. infestansin geneettisessä kartoituksessa (van der Lee et ai., 1997) ja populaatiotutkimuksissa (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et ai., 2003, Flier et ai., 2003). Tällaisia menetelmiä on epäkäytännöllistä käyttää kantojen tietokantojen luomisessa, koska Tulosten kirjanpitoa on käytännössä mahdotonta yhtenäistää, kun analyysejä tehdään eri laboratorioissa.
Huolimatta näennäisestä yksinkertaisuudesta ja nopeudesta (DNA-eristäminen ilman hyvää puhdistusta, monistaminen, tulosten visualisointi), tämä menetelmäryhmä vaatii erityisen menetelmän käyttöä tulosten dokumentoimiseksi: tislaus polyakryyliamidigeelissä leimattujen (radioaktiivisten tai luminesoivien) alukkeiden kanssa ja sen jälkeen altistuminen valolle tai radioaktiiviselle materiaalille. Tavanomainen etidiumbromidiagaroosigeelikuvantaminen ei yleensä sovellu näihin menetelmiin, koska suuri määrä erikokoisia DNA-fragmentteja voi sulautua.
Muut menetelmät päinvastoin mahdollistavat pienen määrän ominaisuuksien tuottamisen niiden erittäin korkealla toistettavuudella. Tähän ryhmään kuuluu mitokondrioiden DNA-haplotyyppien tutkimus (Venäjällä havaitaan vain kaksi haplotyyppiä Ia ja IIa), parittelutyyppi (useimmat isolaatit jaetaan kahteen tyyppiin: A2 ja A1, itsestään hedelmällistä SF: ää löytyy harvoin) ja peptidaasi-isotsyymispektrit (kaksi lokeroa Pep2 ja Pep1 , joka koostuu kummastakin kahdesta isotsyymistä) ja glukoosi-2-fosfaatti-isomeraasista (Venäjällä tälle ominaisuudelle ei ole vaihtelua, vaikka merkittävää polymorfismia havaitaan muissa maailman maissa). On suositeltavaa käyttää näitä ominaisuuksia analysoitaessa kokoelmia, kokoamalla alueellisia ja maailmanlaajuisia tietokantoja. Mitokondrioiden DNA: n isotsyymien ja haplotyyppien analysoinnissa voidaan tehdä ilman standardikantoja lainkaan, kun taas parittelutyyppien analyysissä tarvitaan kaksi testiisolaattia, joilla on tunnetut parittelutyypit.
Reaktio-olosuhteet ja reagenssit voivat vaikuttaa vain tuotteen kontrastiin elektroforetogrammissa; artefaktien ilmentyminen tämäntyyppisissä tutkimuksissa on epätodennäköistä.
Tällä hetkellä suurinta osaa Venäjän eurooppalaisen osan populaatioista edustavat molempien parittelutyyppien kannat (taulukko 6), joukossa on isolaatteja, joiden tyypit Ia ja IIa ovat mitokondrioiden DNA: ta (muita maailmassa löydettyjä mtDNA-tyyppejä ei ole löydetty Venäjältä vuoden 1993 jälkeen). Peptidaasi-isotsyymien spektrejä edustaa kaksi genotyyppiä Pep1-lokuksessa (100/100, 92/92 ja heterotsygootti 92/100, ja 92/92-genotyyppi on erittäin harvinainen (<0,3%)) ja kaksi genotyyppiä Pep 2 -lokuksessa (100/100 , 112/112 ja heterotsygootti 100/112, genotyyppi 112/112 esiintyy harvemmin kuin 100/100, mutta myös melko usein).
Glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasin isoentsyymien kirjassa ei ollut vaihtelua vuoden 1993 jälkeen (klonaalilinjan US-1 katoaminen); kaikilla tutkituilla isolaateilla oli genotyyppi 100/100 (Elansky ja Smirnov, 2002).
Kolmas menetelmäryhmä mahdollistaa riittävän itsenäisten markkeriominaisuuksien ryhmän, jolla on korkea toistettavuus. Nykyään tähän ryhmään kuuluu RFLP-RG57-koetin, joka tuottaa 25-29 erikokoista DNA-fragmenttia. RFLP-RG57: tä voidaan käyttää sekä näytteiden analysointiin että tietokantojen kokoamiseen. Tämä menetelmä on kuitenkin paljon kalliimpaa kuin edelliset, se on aikaa vievää ja vaatii riittävän suuren määrän erittäin puhdistettua DNA: ta. Siksi tutkijan on pakko rajoittaa testatun materiaalin määrää.
RFLP-RG57: n kehitys viime vuosisadan 90-luvun alkupuolella tehosti merkittävästi myöhästyneen taudinaiheuttajan populaatiotutkimuksia. Siitä tuli "Klonaalisten viivojen" valintaan ja analyysiin perustuvan menetelmän perusta (katso alla). RFLP-RG57: n lisäksi kloonisten linjojen tunnistamiseen käytetään parittelutyyppiä, DNA-sormenjälkien ottamista (RFLP-RG57-menetelmä), peptidaasi- ja glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasi-isoentsyymien spektrejä ja mitokondrioiden DNA-tyyppiä. Hänen ansiostaan se osoitettiin al., 1994), vanhojen populaatioiden korvaaminen uusilla (Drenth et al., 1993, Sujkowski et al., 1994, Goodwin et al., 1995a), paljasti monissa maailman maissa vallitsevat klonaaliset linjat. Venäjän kantojen tutkimukset tällä menetelmällä osoittivat korkean genotyyppisen polymorfismin Euroopan osan kannoissa ja monomorfismin Venäjän Aasian ja Kaukoidän osien populaatioissa (Elansky et al, 2001). Ja nyt tämä menetelmä on edelleen tärkein P. infestansin populaatiotutkimuksissa. Kuitenkin sen laajaa jakautumista haittaavat sen melko korkeat kustannukset ja työvoimavaltaisuus toteutuksessa.
Toinen lupaava tekniikka, jota käytetään harvoin P. infestans -tutkimuksissa, on mikrosatelliittitutkimusanalyysi (SSR). Tällä hetkellä tätä menetelmää käytetään laajalti klonaalisten viivojen eristämiseen. Kantojen analysoinnissa käytettiin laajalti (ja käytetään edelleen) sellaisia fenotyyppisiä merkkiaineita kuin virulenssigeenien läsnäolo perunalajikkeille (Avdey, 1995, Ivanyuk et ai., 2002, Ulanova et ai., 2003) ja tomaatti. Tähän mennessä perunalajikkeiden virulenssigeenit ovat menettäneet arvonsa populaatiotutkimusten merkkiaineina, koska virulenssigeenien enimmäismäärä (tai lähellä sitä) esiintyy suuressa osassa isolaatteja. Samaan aikaan T1-virulenssigeeniä vastaavaa Ph1-geeniä kantaville tomaattilajikkeille käytetään edelleen menestyksekkäästi merkkiaineena (Lavrova et ai., 2003; Ulanova et ai., 2003).
Monissa tutkimuksissa fungisidiresistenssiä käytetään markkerina. Tätä ominaisuutta ei ole toivottavaa käyttää populaatiotutkimuksissa johtuen melko helposti esiintyvistä resistenssimutaatioista klonaalisissa linjoissa metallaksyyliä (tai mefenoksaamia) sisältävien fungisidien levittämisen jälkeen. Esimerkiksi merkittävät erot resistenssin tasossa osoitettiin Sib1-kloonilinjalla (Elansky et ai., 2001).
Siten parittelutyyppi, peptidaasi-isoentsyymispektri, mitokondrioiden DNA-tyyppi, RFLP-RG57, SSR ovat edullisia markkeriominaisuuksia tietopankkien luomisessa ja kantojen leimaamisessa kokoelmiin. Jos haluat verrata rajoitettuja näytteitä, jos on tarpeen soveltaa merkkiaineiden enimmäismäärää, voit käyttää AFLP-, RAPD-, InterSSR- ja Inter-SINE PCR -taulukoita (taulukko 5). On kuitenkin muistettava, että nämä menetelmät ovat huonosti toistettavissa, ja kussakin yksittäisessä kokeessa (amplifikaatioelektroforeesisykli) on käytettävä useita vertausisolaatteja.
Taulukko 5. Eri kantojen tutkimusmenetelmien vertailu Infestans
kriteeri | TC | Isoferin poliisit | mtDNA | RFLP-RG57 | RAPD | Issr | SSR | AFLP | kierros |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Tietojen määrä | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Uusittavuus | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Artefaktien mahdollisuus | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Maksaa | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Työvoiman intensiteetti | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Analyysinopeus ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Huomaa: H - matala, C - keskitaso, B - korkea; НС * - työn intensiteetti on pieni käytettäessä agaroosigeeliä tai automaattista
genotyyppi, väliaine - tislaamalla polyakryyliamidigeelissä leimattujen alukkeiden kanssa,
** - laskematta aikaa myseelin kasvattamiseen DNA: n eristämiseen.
Väestörakenne
Klonaaliset viivat
Rekombinaation puuttuessa tai sen merkityksetöntä osuutta populaatiorakenteessa populaatio koostuu tietystä joukosta klooneja, joiden välinen geneettinen vaihto on erittäin harvinaista.
Tällaisissa populaatioissa on informatiivisempaa tutkia ei yksittäisten geenien taajuuksia, vaan niiden genotyyppien taajuuksia, joilla on yhteinen alkuperä (klonaaliset tai klonaaliset sukulinjat) ja jotka eroavat toisistaan vain pistemutaatioiden mukaan. Myöhäiskuun taudinaiheuttajan populaatiotutkimukset ja klonaalisten viivojen analysointi ovat nopeutuneet merkittävästi RFLP-RG57 -menetelmän tulon jälkeen viime vuosisadan 90-luvun alussa. RFLP-RG57: n lisäksi pariutumistyyppiä, peptidaasi- ja glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasi-isoentsyymien spektrejä ja mitokondrioiden DNA-tyyppiä käytetään tunnistamaan klonaaliset linjat. Yleisimpien klonaalilinjojen ominaisuudet on esitetty taulukossa 6.
Klooni US-1 hallitsi populaatioita kaikkialla 80-luvun loppuun saakka, minkä jälkeen se alkoi korvata muilla klooneilla ja katosi Euroopasta ja Pohjois-Amerikasta. Se löytyy nyt Kaukoidästä (Filippiinit, Taiwan, Kiina, Japani, Korea, Koh et ai., 1994, Mosa et al., 1993), Afrikasta (Uganda, Kenia, Ruanda, Goodwin ym., 1994, Vega-Sanchez et. et ai., 2000; Ochwo et ai., 2002) ja Etelä-Amerikassa (Ecuador, Brasilia, Peru, Forbes ym., 1997, Goodwin et ai., 1994). Pelkästään Australiassa ei ole tunnistettu US-1-linjaan kuuluvia kantoja. Ilmeisesti P. infestans -isolaatit tulivat Australiaan uudella muuttoliikkeellä (Goodwin, 1997).
Klooni US-6 muutti Pohjois-Meksikosta Kaliforniaan 70-luvun lopulla ja aiheutti epidemian perunoissa ja tomaateissa 32 vuoden taudista vapaan vuoden jälkeen. Suuren aggressiivisuutensa vuoksi se syrjäytti US-1-kloonin ja alkoi hallita Yhdysvaltojen länsirannikkoa (Goodwin et al., 1995a).
Genotyypit US-7 ja US-8 löydettiin Yhdysvalloista vuonna 1992, ja jo vuonna 1994 niitä levitettiin laajalti Yhdysvalloissa ja Kanadassa. Yhden kenttäkauden aikana klooni US-8 pystyy lähes kokonaan syrjäyttämään kloonin US-1 peruna-aloilla, jotka on alun perin infektoitu molemmilla klooneilla yhtä suurina pitoisuuksina (Miller ja Johnson, 2000).
Kloonit BC-1 - BC-4 on tunnistettu Brittiläisessä Kolumbiassa pienessä määrässä isolaatteja Goodwin et ai., 1995b). Klooni US-11 levisi laajalti Yhdysvalloissa ja syrjäytti US-1: n Taiwanissa. Kloonit JP-1 ja EC-1 sekä klooni US-1 ovat yleisiä Japanissa ja vastaavasti Ecuadorissa (Koh et ai., 1994; Forbes et ai., 1997).
SIB-1 on klooni, joka vallitsi Venäjällä laajalla alueella Moskovan alueelta Sahaliniin. Moskovan alueella se löydettiin vuonna 1993, ja jotkut kenttäpopulaatiot koostuivat pääasiassa tämän klonaalisen linjan kannoista, jotka olivat erittäin resistenttejä metalaksylille. Vuoden 1993 jälkeen tämän kloonin esiintyvyys väheni merkittävästi. Uralin ulkopuolella vuosina 1997-1998 SIB-1: tä löydettiin kaikkialta, lukuun ottamatta Khabarovskin aluetta (klooni SIB-2 on siellä laajasti levinnyt). Kloonien alueellinen erottelu erityyppisillä parittelulla sulkee pois seksuaalisen prosessin Siperiassa ja Kaukoidässä. Moskovan alueella, toisin kuin Siperiassa, väestöä edustavat monet kloonit; melkein jokaisella isolaatilla on ainutlaatuinen monitahoinen genotyyppi (Elansky et ai., 2001, 2015). Tätä monimuotoisuutta ei voida selittää pelkästään sienikantojen tuonnilla eri puolilta maailmaa tuodulla siemenmateriaalilla. Koska molempia parittelutyyppejä esiintyy populaatiossa, on mahdollista, että sen monimuotoisuus johtuu myös rekombinaatiosta. Siten British Columbiassa oletetaan, että genotyypit BC-2, BC-3 ja BC-4 syntyvät kloonien BC-1 ja US-6 hybridisaation vuoksi (Goodwin et ai., 1995b). On mahdollista, että hybridikantoja löytyy Moskovan populaatioista. Esimerkiksi PE-lokukselle heterotsygootit kannat MO-4, MO-8 ja MO-11 voivat olla hybridien kantojen MO-12, MO-21, MO-22 välillä, joilla on A2-pariliitostyyppi, ja homotsygoottiset PEP-lokuksen ja kannan yhdelle alleelille. MO-8, jolla on A1-parittelutyyppi ja joka on homotsygoottinen lokuksen toiselle alleelille. Ja jos näin on, ja P. infestansin nykyaikaisissa populaatioissa on taipumus lisääntyä seksuaalisen prosessin rooli, monikeskittymiskloonien analyysin informaatioarvo pienenee (Elansky et ai., 2001, 2015).
Vaihtelu klonaalisissa viivoissa
90-luvun 20-luvulle saakka klonaalinen viiva US-1 oli levinnyt maailmassa. Suurin osa kenttä- ja alueellisista populaatioista koostui yksinomaan kannoista, joilla oli US-1-genotyyppi. Eristyksiä havaittiin kuitenkin myös isolaattien välillä, mikä todennäköisesti johtui mutaatioprosessista. Mutaatioita esiintyi sekä ydin- että mitokondrioiden DNA: ssa, ja ne vaikuttivat muun muassa fenyyliamidilääkkeiden resistenssin tasoon ja virulenssigeenien määrään. Linjat, jotka poikkeavat alkuperäisistä genotyypeistä mutaatioiden avulla, on merkitty lisänumeroilla alkuperäisen genotyypin nimeä seuraavan pisteen jälkeen (esimerkiksi US-1.1-kloonilinjan mutanttilinja US-1). Sormenjälkitunnistavat DNA-linjat US-1.5 ja US-1.6 sisältävät erikokoisia lisälinjoja (Goodwin et ai., 1995a, 1995b); klonaalinen viiva US-6.3 eroaa US-6: sta myös yhdellä lisälinjalla (Goodwin, 1997, taulukko 7).
Mitokondrioiden DNA: ta tutkittaessa havaittiin, että vain tyypin 1b mitokondrioiden DNA löytyy klonaalisesta linjasta US-1 (Carter et ai., 1990). Tutkittaessa tämän Perusta ja Filippiineiltä peräisin olevan klonaalisen linjan kantoja löydettiin isolaatteja, joiden mitokondrioiden DNA-tyypit poikkesivat 1b: stä insertioiden ja deleetioiden läsnäolon perusteella (Goodwin, 1991, Koh et ai., 1994).
Taulukko 6. Joidenkin P. infestans -klonaalilinjojen monitarkennusgenotyypit
Nimi | Parittelutyyppi | Isotsyymit | DNA-sormenjäljet | MtDNA-tyyppi | |
GPI-laajennus | PEP | ||||
USA-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011 24 + | Ib |
USA-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011 24 + | - |
USA-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011 24 + | - |
USA-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011 24 + | - |
USA-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011 24 + | - |
USA-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011 24 + | Hb |
USA-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011 24 + | Ia |
USA-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011 24 + | Ia |
USA-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
USA-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
USA-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011 24 + | Hb |
USA-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | - |
USA-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011 24 + | - |
USA-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | Ia |
USA-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011 24 + | - |
USA-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011 24 + | - |
USA-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | Ia |
USA-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011 24 + | Ia |
EY-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011 24 + | Ila |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 24 + | Ila |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 24 + | Ila |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011 24 + | Ila |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 24 + | Ila |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 24 + | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011 24 + | Ila |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011 24 + | Ila |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011 24 + | Ila |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 24 + | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011 24 + | Ila |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011 24 + | Ila |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | Ila |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011 24 + | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011 24 + | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 24 + | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011 22 + | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011 23 + | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011 24 + | Ila |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011 24 + | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011 24 + | Ila |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | Ila |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | Ila |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | Ila |
Huomaa: * - ei tietoja.
Taulukko 7. Monitarkennusgenotyypit ja niiden mutanttilinjat
Nimi | Parittelutyyppi | | DNA-sormenjäljet (RG57) | Huomautuksia | |
GPI-laajennus | PEP-1 | ||||
USA-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Alkuperäinen genotyyppi 1 |
USA-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutaatio PEP: ssä |
USA-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutaatio RG57: ssä |
USA-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutaatio RG57: ssä |
USA-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutaatio RG57: ssä ja PEP: ssä |
USA-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutaatio RG57: ssä |
USA-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Alkuperäinen genotyyppi 2 |
USA-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutaatio PEP: ssä |
USA-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutaatio RG57: ssä |
USA-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutaatio RG57: ssä |
USA-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutaatio RG57: ssä ja PEP: ssä |
USA-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutaatio RG57: ssä |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Alkuperäinen genotyyppi 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutaatio RG57: ssä |
Isotsyymien spektreissä on myös muutoksia. Yleensä ne johtuvat tälle entsyymille aluksi heterotsygotin organismin hajoamisesta homotsygoottisiksi. Vuonna 1993 tomaatin hedelmistä tunnistimme kannan, jolla oli tunnusomaista US-1: lle: RG57-sormenjälkien ottaminen, mitokondrioiden DNA-tyyppi ja 86/100 genotyyppi glukoosi-6-fosfati-isomeraasille, mutta se oli homotsygoottinen (100/100) ensimmäiselle peptidaasilokalle tälle klonaaliselle linjalle tyypillinen 92/100 heterotsygootti. Nimeimme tämän kannan genotyypin MO-17 (taulukko 6). Mutanttilinjat US-1.1 ja US-1.4 eroavat myös US-1: stä ensimmäisen peptidaasilokan mutaatioiden avulla (taulukko 7).
Peruna- ja tomaattilajikkeiden virulenssigeenien määrän muutoksiin johtavat mutaatiot ovat melko yleisiä. Ne havaittiin klonaalilinjan US-1 isolaattien joukossa populaatioissa Hollannista (Drenth et ai., 1994), Perusta (Goodwin et ai., 1995a), Puolasta (Sujkowski et ai., 1991), Pohjois-Pohjois-Amerikasta (Goodwin et al. 1995b). Perunavirulenssigeenien lukumäärässä havaittiin myös eroja kloonilinjojen US-7 ja US-8 isolaattien välillä Kanadassa ja Yhdysvalloissa (Goodwin et ai., 1995a), SIB-1-linjan isolaattien joukossa Venäjän Aasian osassa (Elansky et al, 2001 ).
Eristettyjä aineita, joilla oli voimakkaita eroja resistenssin suhteen fenyyliamidilääkkeille, tunnistettiin monoklonaalisten kenttien populaatioissa, jotka kaikki kuuluivat klonaaliseen linjaan Sib-1 (Elansky et ai., 2001, taulukko 1). Lähes kaikki klonaalisen linjan US-1 kannat ovat erittäin herkkiä metalaksyylille; tämän linjan erittäin resistentit isolaatit eristettiin kuitenkin Filippiineillä (Koh et ai., 1994) ja Irlannissa (Goodwin et ai., 1996).
P. infestansin nykyaikaiset populaatiot
Keski-Amerikka (Meksiko)
Meksikon P. infestans -väestö eroaa selvästi muista maailman väestöistä, mikä johtuu pääasiassa sen historiallisesta asemasta. Lukuisat tutkimukset tästä populaatiosta ja siihen liittyvistä Phytophthora-heimoon kuuluvista P. infestans -lajeista sekä Solanum-suvun paikallisista lajeista johtivat johtopäätökseen, että taudinaiheuttajan evoluutio Meksikon keskiosassa tapahtui yhdessä isäntäkasvien evoluution kanssa ja liittyi seksuaaliseen rekombinaatioon (Grünwald, Flier , 2005). Molemmat parittelutyypit ovat edustettuina populaatiossa ja yhtä suurina osuuksina, ja oosporien läsnäolo maaperässä, perunoiden kasveissa ja mukuloissa sekä luonnonvaraisiin Solanum-lajeihin vahvistaa seksuaalisen prosessin esiintymisen populaatiossa (Fernández-Pavía et al., 2002). Viimeaikaiset tutkimukset Tolucan laaksosta ja sen ympäristöistä (taudinaiheuttajan oletettu alkuperäkeskus) vahvistivat P. infestansin paikallisen populaation korkean geneettisen monimuotoisuuden (134 monitarkoista genotyyppiä 176 näytteen näytteessä) ja useiden eriytyneiden alaryhmien läsnäolon alueella (Wang et al., 2017). Tähän erilaistumiseen vaikuttavat tekijät ovat Keski-Meksikon ylängöille ominaista alaryhmien alueellinen jakautuminen, erot viljelyolosuhteissa ja laaksoissa ja vuoristossa käytetyissä perunalajikkeissa sekä villien mukulaisten Solanum-lajien esiintyminen, jotka voivat toimia vaihtoehtoisina isäntinä (Fry et al. ., 2009).
On kuitenkin huomattava, että P. infestansin populaatiot Pohjois-Meksikossa ovat luonteeltaan kloonisempia ja ovat samankaltaisempia kuin Pohjois-Amerikan populaatiot, mikä saattaa viitata siihen, että nämä ovat uusia genotyyppejä (Fry et al., 2009).
Pohjois-Amerikka
Pohjois-Amerikan P. infestans -populaatioilla on aina ollut hyvin yksinkertainen rakenne, ja niiden klonaalinen luonne vahvistettiin kauan ennen mikrosatelliittianalyysin käyttöä. Vuoteen 1987 asti klonaalinen viiva US-1 hallitsi Yhdysvalloissa ja Kanadassa (Goodwin et ai., 1995). 70-luvun puolivälissä, kun metalaksyylipohjaiset fungisidit ilmestyivät, tämä klooni alkoi korvata muilla Meksikosta muuttaneilla, vastustuskykyisemmillä genotyypeillä (Goodwin et ai., 1998). 90-luvun loppuun mennessä. US-8-genotyyppi korvasi kokonaan US-1-genotyypin Yhdysvalloissa ja siitä tuli hallitseva klonaalinen linja perunoilla (Fry et ai., 2009; Fry et ai., 2015). Tilanne oli erilainen tomaattien kohdalla, jotka sisälsivät jatkuvasti useita klonaalisia viivoja, ja niiden koostumus muuttui vuodesta toiseen (Fry et al., 2009).
Vuonna 2009 Yhdysvalloissa puhkesi laaja tomaatti-epidemia. Tämän pandemian piirre oli sen melkein samanaikainen puhkeaminen monissa paikoissa Yhdysvaltojen koillisosassa, ja se osoittautui liittyvän tartunnan saaneiden tomaattitaimien valtavaan myyntiin suurissa puutarhakeskuksissa (Fry et al., 2013). Satohäviöt olivat valtavat. Vaikuttavien näytteiden mikrosatelliittianalyysi paljasti, että pandemiakanta kuului klonaalilinjan US-22 A2-tyyppiseen paritteluun. Vuonna 2009 tämän genotyypin osuus P. infestansin amerikkalaisesta populaatiosta oli 80% (Fry et ai., 2013). Seuraavina vuosina aggressiivisten genotyyppien US-23 (pääasiassa tomaattien) ja US-24 (perunoiden) osuus kasvoi tasaisesti väestössä, mutta vuoden 2011 jälkeen US-24: n havaitsemisaste laski merkittävästi ja tähän mennessä noin 90% patogeenipopulaatiosta Yhdysvaltoja edustaa US-23-genotyyppi (Fry et ai., 2015).
Kanadassa, kuten Yhdysvalloissa, 90-luvun lopulla. US-1 syrjäytti hallitsevan genotyypin US-8, jonka hallitseva asema pysyi muuttumattomana vuoteen 2008 saakka. Vuosina 2009-2010. Kanadassa tartunnan saaneiden tomaattitaimien myyntiin liittyi vakavia myöhäisrokkoepidemioita, mutta ne johtuivat genotyypeistä US-23 ja US-8 (Kalischuk et ai., 2012). Näiden genotyyppien selkeä maantieteellinen erottelu oli huomattava: USA-23 hallitsi Kanadan läntisiä provinsseja (68%), kun taas US-8 hallitsi itäisiä provinsseja (83%). Seuraavina vuosina USA-23 levisi itäisille alueille; yleisesti ottaen sen osuus väestöstä laski kuitenkin hieman, kun otetaan huomioon genotyyppien US-22 ja US-24 esiintyminen maassa (Peters et al., 2014). Tähän mennessä US-23: lla on hallitseva asema koko Kanadassa; US-8 on läsnä British Columbiassa, kun taas US-23 ja US-24 ovat läsnä Ontariossa (Peters, 2017).
Siten P. infestansin Pohjois-Amerikan populaatiot ovat pääasiassa klonaalisia viivoja. Viimeisten 40 vuoden aikana havaittujen klonaalisten genotyyppien määrä on noussut 24. Huolimatta siitä, että populaatiossa on molempien parittelutyyppien kantoja, uusien genotyyppien esiintymisen todennäköisyys seksuaalisen rekombinaation seurauksena on edelleen melko pieni. Viimeisten 20 vuoden aikana on kuitenkin kirjattu useita tapauksia lyhytaikaisten yhdistelmäpopulaatioiden esiintymisestä (Gavino et ai., 2000; Danies et ai., 2014; Peters et ai., 2014), ja yhdessä tapauksessa ylityksen tulos oli genotyyppi US-11. , joka oli vakiintunut Pohjois-Amerikassa monien vuosien ajan (Gavino et al., 2000). Vuoteen 2009 asti populaatiorakenteen muutokset liittyivät uusien, aggressiivisempien genotyyppien ilmaantumiseen ja niiden myöhempään muuttoliikkeeseen ja aiemmin hallitsevien edeltäjien siirtymiseen. Mitä tapahtui vuosina 2009-2010 Yhdysvalloissa ja Kanadassa, epifytoosi osoitti ensimmäistä kertaa, että globalisaation aikakaudella taudin puhkeaminen voi liittyä uusien genotyyppien aktiiviseen leviämiseen myydessään tartunnan saanutta istutusmateriaalia.
Etelä-Amerikka
Viime aikoihin asti tutkimukset Etelä-Amerikan P. infestans -populaatioista eivät olleet säännöllisiä eikä laajamittaisia. Tiedetään, että näiden populaatioiden rakenne on melko yksinkertainen ja sisältää 1-5 klonaalista sukua per maa (Forbes et ai., 1998). Joten vuoteen 1998 mennessä genotyypit US-1 (Brasilia, Chile) BR-1 (Brasilia, Bolivia, Uruguay, Paraguay), EC-1 (Ecuador, Kolumbia, Peru ja Venezuela), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 ja AR-5 (Argentiina), PE-3 ja PE-7 (Etelä-Peru). Parittelutyyppiä A2 esiintyi Brasiliassa, Boliviassa ja Argentiinassa, eikä sitä löytynyt Bolivian ja Perun rajan takana Titicaca-järven alueella, jonka takana Andeilla hallitsi EC-1 A1-genotyyppi. Tomaateissa US-1 pysyi hallitsevana genotyyppinä koko Etelä-Amerikassa.
Tilanne jatkui enemmän tai vähemmän 2000-luvulla. Tärkeä seikka oli uuden A2-tyyppisen klonaalilinjan EC-2 löytäminen perunoiden (S. brevifolium ja S. tetrapetalum) luonnonvaraisista sukulaisista Pohjois-Andeilla (Oliva et ai., 2010). Fylogeneettiset tutkimukset ovat osoittaneet, että tämä linja ei ole täysin identtinen P. infestansin kanssa, vaikka se liittyy läheisesti siihen, tässä yhteydessä ehdotettiin sen tarkastelemista samoin kuin toisen linjan, EC-3: n, eristämistä Andeissa kasvavasta tomaattipuusta S. betaceum, uusi laji nimeltä P. andina; tämän lajin (riippumaton laji tai P. infestans -hybridi, jolla on vielä tuntematon linja) tila on kuitenkin edelleen epäselvä (Delgado et ai., 2013).
Tällä hetkellä kaikki Etelä-Amerikan P. infestans -populaatiot ovat kloonisia. Molemmista parittelutyypeistä huolimatta rekombinanttipopulaatioita ei ole tunnistettu. Tomaateilla US-1-genotyyppi on läsnä kaikkialla, ilmeisesti syrjäyttäen perunasta paikalliset kannat, joiden tarkkaa alkuperää ei vielä tunneta. Brasiliassa, Boliviassa ja Uruguayssa BR-1-genotyyppi on läsnä; Perussa on US-1: n ja EC-1: n lisäksi useita muita paikallisia genotyyppejä. Andeilla hallitseva asema säilyy klonaalisella viivalla EC-1, jonka suhdetta äskettäin löydettyyn P. andinaan ei tunneta. Ainoa "epävakaa" paikka vuosina 2003-2013. väestössä tapahtui merkittäviä muutoksia, josta tuli Chile (Acuña et al., 2012), jossa vuosina 2004-2005. patogeenipopulaatiolle oli tunnusomaista resistenssi metalaksyylille ja uusi mitokondrioiden DNA-haplotyyppi (Ia aiemmin läsnä olevan Ib: n sijasta). 2006--2011 Populaatiossa dominoi genotyyppi 21 (SSR: n mukaan), jonka osuus oli 90%, minkä jälkeen kämmen siirtyi genotyyppiin 20, jonka esiintymistiheys kahden seuraavan vuoden aikana pidettiin noin 67%: ssa (Acuña, 2015).
Eurooppa
Euroopan historiassa on esiintynyt ainakin kaksi P. infestans -muuton aaltoa Pohjois-Amerikasta: 1-luvulla. (HERB-1) ja 70-luvun alku (US-1). Metalaksyyliä sisältävien sienitautien leviäminen kaikkialla XNUMX-luvulla. johti hallitsevan genotyypin US-XNUMX syrjäyttämiseen ja sen korvaamiseen uusilla genotyypeillä. Tämän seurauksena useimmissa Länsi-Euroopan maissa taudinaiheuttajan populaatiot edustivat pääasiassa useita klonaalisia viivoja.
Mikrosatelliittianalyysin käyttö patogeenipopulaatioiden analysoinnissa mahdollisti Länsi-Euroopassa vuosina 2005–2008 tapahtuneiden vakavien muutosten tunnistamisen. Vuonna 2005 Yhdistyneestä kuningaskunnasta löydettiin uusi klonaalinen linja, nimeltään 13_A2 (tai “Blue 13”), jolle oli tunnusomaista A2-parittelutyyppi , korkea aggressiivisuus ja resistenssi fenyyliamideille (Shaw et ai., 2007). Sama genotyyppi löydettiin vuonna 2004 Alankomaissa ja Pohjois-Ranskassa kerätyistä näytteistä, mikä viittaa siihen, että se muutti Yhdistyneeseen kuningaskuntaan Manner-Euroopasta mahdollisesti siemenperunoiden kanssa (Cooke et al., 2007). Tämän klonaalisen linjan edustajien genomin tutkimus osoitti sen sekvenssin korkean polymorfismin (vuoteen 2016 mennessä sen subklonaalisten variaatioiden määrä oli 340) ja geeniekspressiotason, mukaan lukien, huomattava vaihtelu. efektorigeenit kasvainfektion aikana (Cooke et ai., 2012; Cooke, 2017). Nämä piirteet yhdessä biotrofisen vaiheen pitenemisen kanssa voivat aiheuttaa 13_A2: n lisääntyneen aggressiivisuuden ja sen kyvyn tartuttaa jopa myöhään särkyä vastustavat perunalajikkeet.
Lähivuosina genotyyppi levisi nopeasti Luoteis-Euroopan maihin (Iso-Britannia, Irlanti, Ranska, Belgia, Alankomaat, Saksa) syrjäyttämällä samanaikaisesti aiemmin hallitsevat genotyypit 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry ym., 2010; Gisi ym. , 2011; Van den Bosch et ai., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Verkkosivuston www.euroblight.net mukaan 13_A2: n osuus näiden maiden väestöistä oli 60-80% ja enemmän; tämän genotyypin läsnäolo on todettu myös joissakin Itä- ja Etelä-Euroopan maissa. Vuosina 2009--2012. 13_A2 menetti hallitsevan asemansa Isossa-Britanniassa ja Ranskassa, mikä antoi 6_A1-linjalle (8_A1 Irlannissa), ja Alankomaissa ja Belgiassa se korvattiin osittain genotyypeillä 1_A1, 6_A1 ja 33_A2 (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Tähän mennessä noin 70% P. infestansin Länsi-Euroopan väestöstä on monoklonaalista. Sivuston www.euroblight.net mukaan Luoteis-Euroopan maissa (Iso-Britannia, Ranska,
Alankomaat, Belgia) ovat edelleen suunnilleen yhtä suurina osuuksina 13_A2 ja 6_A1, jälkimmäistä ei käytännössä löydy määritetyn alueen ulkopuolelta (Irlantia lukuun ottamatta), mutta sillä on jo vähintään 58 alakloonia (Cooke, 2017). Muunnelmia 13_A2 esiintyy huomattavasti Saksassa, ja niitä esiintyy satunnaisesti myös Keski- ja Etelä-Euroopan maissa. Genotyyppi 1_A1 muodostaa merkittävän osan Belgian ja osittain Alankomaiden ja Ranskan populaatioista. Genotyyppi 8_A1 on vakiintunut Euroopan väestössä 3-6 prosentin tasolle lukuun ottamatta Irlantia, jossa se säilyttää johtoasemansa ja on jaettu kahteen alaklooniin (Stellingwerf, 2017). Viime vuonna uusien genotyyppien 2016_A36 ja 2_A37 esiintyvyys lisääntyi ensimmäisen kerran vuosina 2--2013; Tähän mennessä näitä genotyyppejä on Alankomaissa ja Belgiassa sekä osittain Ranskassa ja Saksassa sekä Ison-Britannian eteläosassa (Cooke, 2014). Noin 2017-20% Länsi-Euroopan väestöstä edustaa ainutlaatuisia genotyyppejä vuosittain.
Toisin kuin Länsi-Euroopassa, 13_A2-genotyypin ilmestyessä Pohjois-Euroopan (Ruotsi, Norja, Tanska, Suomi) populaatiot eivät olleet edustettuina klonaalisilla viivoilla, mutta suurella määrällä ainutlaatuisia genotyyppejä (Brurberg et ai.,
2011). 13_A2: n aktiivisen leviämisen aikana Länsi-Euroopassa tämän genotyypin läsnäolo Skandinaviassa havaittiin vasta vuonna 2011, jolloin se havaittiin ensimmäisen kerran Pohjois-Jyllannissa (Tanska), jossa pääasiassa teollisia perunalajikkeita viljellään aktiivisesti metalaksyyliä sisältävien sienitautien torjunta-aineet (Nielsen et ai., 2014). Www.euroblight.netin mukaan genotyyppi 13_A2 havaittiin myös useissa näytteissä Norjasta ja Tanskasta vuonna 2014 ja useista norjalaisista näytteistä vuonna 2016; Lisäksi vuonna 2013 havaittiin, että genotyyppi 6_A1 esiintyi pienessä määrin Suomessa. Tärkein syy 13_A2: n ja muiden klonaalisten viivojen epäonnistumiseen Skandinavian valloituksessa pidetään tämän alueen ilmastoeroina Länsi-Euroopan maista.
Sen lisäksi, että viileät kesät ja kylmät talvet myötävaikuttavat oosporien selviytymiseen vegetatiivisen sienirihmaston sijasta (Sjöholm et al., 2013), maaperän jäätyminen talvella (jota ei yleensä tapahdu Länsi-Euroopan lämpimissä maissa) edistää oosporien itämisen ja istutuksen synkronoitumista. peruna, mikä parantaa niiden roolia ensisijaisen infektion lähteenä (Brurberg et al., 2011). On myös huomattava, että pohjoisissa olosuhteissa oosporien infektion kehittyminen ylittää mukulainfektion kehittymisen, mikä lopulta estää vielä aggressiivisempien, mutta myöhemmin kehittyneiden klonaalisten linjojen dominoinnin (Yuen, 2012). Itä-Euroopan maiden (Puola, Baltian maat) tutkituimpien P. infestans -populaatioiden rakenne on hyvin samanlainen kuin Skandinaviassa.
Molempia parittelutyyppejä esiintyy myös täällä, ja valtaosa SSR-analyysillä määritetyistä genotyypeistä on ainutlaatuisia (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et ai., 2016). Kuten Pohjois-Euroopassa, kloonilinjojen (pääasiassa 13_A2-genotyypin) leviäminen ei käytännössä vaikuttanut taudinaiheuttajan paikallisiin populaatioihin, jotka säilyttävät korkean monimuotoisuuden ilman selkeitä hallitsevia linjoja.
13_A2: n esiintymistä havaitaan toisinaan pelloilla, joilla on kaupallisia perunalajikkeita. Venäjällä tilanne kehittyy samalla tavalla. Vuosina 2008-2011 kerättyjen P. infestans -isolaattien mikrosatelliittianalyysi 10 eri alueella Venäjän eurooppalaisessa osassa osoitti suurta genotyyppistä monimuotoisuutta ja täydellistä puuttumista sattumista eurooppalaisten kloonilinjojen kanssa (Statsyuk et al., 2014). Useita vuosia myöhemmin Leningradin alueella vuosina 2013--2014 kerättyjen P. infestans -näytteiden tutkimus osoitti merkittäviä eroja niiden ja edellisessä tutkimuksessa tunnistettujen tämän alueen genotyyppien välillä. Molemmissa tutkimuksissa ei löytynyt Länsi-Euroopan genotyyppejä (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2016).
P. infestansin itäisen Euroopan populaatioiden suuri geneettinen monimuotoisuus ja hallitsevien klonaalisten viivojen puuttuminen niistä voivat johtua useista syistä. Ensinnäkin, kuten Pohjois-Euroopassa, tarkasteltavien maiden ilmasto-olosuhteet edistävät oosporien muodostumista ensisijaisena infektiolähteenä (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et ai., 2014). Toiseksi merkittävä osa näissä maissa tuotetuista perunoista viljellään pienillä yksityisillä maatiloilla, joita usein ympäröivät metsät tai muut esteet tarttuvan materiaalin vapaalle liikkuvuudelle (Chmielarz et al., 2014). Yleensä tällaisissa olosuhteissa kasvatettuja perunoita ei käytännössä käsitellä kemikaaleilla, ja lajikkeiden valinta perustuu niiden myöhäiseen särkyvyyteen, ts. ei ole valikoivaa painetta aggressiivisuudelle ja resistenssille metalaksyyliin, mikä vie resistentit genotyypit, kuten 13_A2, eduista muihin genotyyppeihin nähden (Chmielarz et ai., 2014). Tonttien pienen koon takia niiden omistajat eivät yleensä harjoittele viljelykierrosta, kasvattavat perunoita vuosia samassa paikassa, mikä osaltaan edistää geneettisesti monimuotoisen ympyrän kertymistä (Runno-Paurson ym., 2016; Elansky, 2015; Elansky ym. ., 2015).
Aasia
Viime aikoihin asti P. infestans-populaatioiden rakenne Aasiassa pysyi suhteellisen huonosti ymmärrettynä. Tiedettiin, että sitä edustavat pääasiassa klonaaliset viivat, ja seksuaalisen rekombinaation vaikutus uusien genotyyppien syntymiseen on hyvin pieni. Joten esimerkiksi vuosina 1997-1998. Venäjän Aasian osassa (Siperia ja Kaukoitä) patogeenipopulaatiota edustivat vain kolme genotyyppiä, joissa vallitsi SIB-1-genotyyppi (Elansky et al., 2001). Kloonisten patogeenilinjojen läsnäolo on osoitettu esimerkiksi Kiinassa, Japanissa, Koreassa, Filippiineillä ja Taiwanissa (Koh et ai., 1994; Chen et ai., 2009). Klonaalinen viiva US-1 hallitsi suurta Aasian aluetta 90-luvun lopulla - 2000-luvun alussa. melkein kaikkialla alettiin korvata muilla genotyypeillä, jotka puolestaan antoivat tilaa uusille. Useimmiten Aasian maiden populaatiorakenteen ja koostumuksen muutokset liittyivät uusien genotyyppien migraatioon ulkopuolelta. Joten Japanissa JP-3-genotyyppiä lukuun ottamatta kaikilla muilla US-1: n jälkeen ilmestyneillä japanilaisilla genotyypeillä (JP-1, JP-2, JP-3) on enemmän tai vähemmän todistettu ulkoinen alkuperä (Akino ym., 2011) ... Kiinassa on tällä hetkellä kolme pääpatogeenipopulaatiota, joilla on selkeä maantieteellinen jakauma; Näiden populaatioiden välillä ei ole lainkaan tai hyvin heikkoa geenivirtaa (Guo et ai., 2010; Li et ai., 2013b). Genotyyppi 13_A2 ilmestyi Kiinan alueella sen eteläisissä maakunnissa (Yunnan ja Sichuan) vuosina 2005-2007 ja vuosina 2012-1014. nähtiin myös maan koillisosassa (Li ym., 2013b). Intiassa 13_A2 esiintyi oletettavasti samaan aikaan kuin Kiina, todennäköisesti tartunnan saaneilla siemenperunoilla (Chowdappa et al., 2015) ja vuosina 2009-2010. aiheutti maan eteläosassa tomaatille vakavan myöhäisrokotuksen taudin, jonka jälkeen se levisi perunoihin ja aiheutti myöhäisrokotuksen puhkeamisen Länsi-Bengalissa, mikä johti monien paikallisten maanviljelijöiden tuhoon ja itsemurhaan (Fry, 2014).
Afrikka
Vuoteen 2008--2010 saakka systemaattisia tutkimuksia P. infestansista Afrikan maissa ei ole tehty. Tällä hetkellä P. infestansin afrikkalaiset populaatiot voidaan jakaa kahteen ryhmään, ja tämä jakautuminen liittyy selvästi siemenperunoiden tuontiin Euroopasta.
Pohjois-Afrikassa, joka tuo aktiivisesti siemenperunoita Euroopasta, A2-parittelutyyppi on laajasti edustettuna lähes kaikilla alueilla, mikä tarjoaa teoreettisen mahdollisuuden uusien genotyyppien syntymiseen seksuaalisen yhdistämisen seurauksena (Corbière et al., 2010; Rekad et ai., 2017). Lisäksi Algeriassa havaitaan genotyyppien 13_A2, 2_A1 ja 23_A1 esiintyminen, joista ensimmäinen on selvästi dominoiva, sekä ainutlaatuisten genotyyppien osuuden asteittainen väheneminen täydelliseen katoamiseen asti (Rekad et al., 2017). Toisin kuin muualla alueella, Tunisiassa (lukuun ottamatta maan koillisosaa) taudinaiheuttajien populaatiota edustaa pääasiassa A1-parittelutyyppi (Harbaoui et al., 2014).
Klonaalinen linja NA-01 on tässä hallitseva. Kloonisten linjojen osuus väestöstä on yleensä vain 43%. Itä- ja Etelä-Afrikassa, jossa siementen tuonnin määrä on häviävän pieni (Fry et ai., 2009), P. infestansia edustavat vain kaksi klonaalista A1-tyyppistä linjaa, US-1 ja KE-1, ja jälkimmäinen syrjäyttää aktiivisesti ensimmäisen perunoilla ( Pule et ai., 2012; Njoroge et ai., 2016). Tähän mennessä molemmilla näistä genotyypeistä on huomattava määrä subklonaalisia vaihteluita.
Australia
Ensimmäinen raportti perunoiden myöhäisrokotuksesta Australiassa on vuodelta 1907, ja ensimmäinen epifytotia, jonka oletetaan aiheuttaneen kesäkuukausien sateet, esiintyi vuosina 1909-1911. (Drenth et ai., 2002). Yleensä myöhäisillä rukoilla ei kuitenkaan ole merkittävää taloudellista merkitystä maalle. Satunnaista myöhäisrokotusta, jonka aiheuttavat korkean kosteuden aikaansaavat sääolosuhteet, esiintyy enintään kerran 5-7 vuoden välein ja ne sijaitsevat pääasiassa Tasmanian pohjoisosassa ja Victorian keskustassa. Edellä mainitun yhteydessä julkaisuja, jotka on omistettu P. infestansin Australian populaation rakenteen tutkimiseen, ei käytännössä ole. Viimeisimmät saatavilla olevat tiedot ovat vuosilta 1998-2000. (Drenth et ai., 2002). Kirjoittajien mukaan Victoria-osavaltion populaatio oli klonaalinen linja US-1.3, mikä vahvisti epäsuorasti tämän genotyypin muuttoliikkeen Yhdysvalloista. Tasmanian yksilöt luokiteltiin AU-3: ksi, poikkeavat genotyypeistä, joita oli tuolloin muualla maailmassa.
Venäjän myöhäisrokotuksen kehittymisen piirteet
Euroopassa infektio, joka johtui sairaista siemen mukuloista, maaperässä talvehtivista oosporeista sekä viime vuoden peltoalueilla talvehtineista mukuloista kasvatettujen kasvien ("vapaaehtoiset" kasvit) tai teurastettujen kasojen tuulen tuomista zoosporangioista kirjanmerkki mukuloiden varastointiin. Näistä hylättyjen mukuloiden kasoilla kasvatettuja kasveja pidetään vaarallisimpina infektiolähteinä. itäneiden mukuloiden määrä on usein merkittävä, ja niistä voi kuljettaa eläintarhoja pitkiä matkoja. Muut lähteet (oosporit, "vapaaehtoiset" kasvit) eivät ole niin vaarallisia, koska kasvien viljely samoilla pelloilla ei ole tapana useammin kuin 3-4 vuoden välein. Sairaiden siemen mukuloiden aiheuttama infektio on myös vähäistä hyvän siemenlaadunvalvontajärjestelmän ansiosta.
Inokulaatin määrä Euroopan populaatioissa on yleensä rajallinen, ja siksi epidemian kasvu on melko hidasta ja sitä voidaan hallita onnistuneesti kemiallisilla fungisidivalmisteilla. Tärkein tehtävä Euroopan olosuhteissa on taistelu infektiota vastaan siinä vaiheessa, kun zoosporangian massa leviäminen tartunnan saaneista kasveista alkaa.
Venäjällä tilanne on täysin erilainen. Suurin osa peruna- ja tomaattisadosta viljellään pienissä yksityisissä puutarhoissa; suojatoimenpiteitä ei joko suoriteta lainkaan, tai sienitautien torjuntatoimenpiteitä suoritetaan riittämättömässä määrin ja ne alkavat sen jälkeen, kun latvoihin on ilmestynyt latvoissa. Tämän seurauksena yksityiset vihannespuutarhat toimivat tärkeimpänä tartuntalähteenä, josta tuuli kuljettaa eläintarhoja kaupallisille istutuksille. Tämän vahvistavat suorat havainnot Moskovassa, Bryanskissa, Kostromassa, Ryazanin alueilla: yksityisten puutarhojen kasvien vaurioituminen havaitaan jo ennen kaupallisten istutusten sienitautien torjunta-aineen käsittelyä. Tämän jälkeen suurten peltojen epidemia hillitsee sienitautien torjunta-aineita, kun taas yksityisissä puutarhoissa myöhäisrokotus kehittyy nopeasti.
Kaupallisten istutusten virheellisen tai "budjetin" käsittelyn yhteydessä kentissä esiintyy myöhäisrokkoa myöhemmin he kehittyvät aktiivisesti, kattaen yhä suuremmat alueet (Elansky, 2015). Yksityisten puutarhojen tartunnalla on merkittävä vaikutus kaupallisten kenttien epidemioihin. Kaikilla Venäjän perunanviljelyalueilla yksityisten puutarhojen perunoiden pinta-ala on useita kertoja suurempi kuin suurten tuottajien peltojen kokonaispinta-ala. Tällaisessa ympäristössä yksityisiä vihannespuutarhoja voidaan pitää globaaleina inokulaattiresursseina kaupallisille pelloille. Yritetään tunnistaa ne ominaisuudet, jotka ovat ominaisia yksityisten puutarhojen kantojen genotyypeille.
Varastoperunoiden, epäilyttäviltä ulkomaisilta tuottajilta saatujen tomaattisiementen, perunoiden ja tomaattien pitkäaikainen viljely samoille alueille, epäasianmukainen sienitautien käsittely tai niiden täydellinen puuttuminen johtaa yksityisen sektorin vakaviin epifytotuksiin, joiden tulos on ilmainen. risteytys, hybridisaatio ja oosporien muodostuminen yksityisissä puutarhoissa. Tämän seurauksena patogeenin genotyyppinen monimuotoisuus havaitaan erittäin korkealla, kun melkein jokainen kanta on genotyypillään ainutlaatuinen (Elansky et ai., 2001, 2015). Erilaisen geneettisen alkuperän siemenperunoiden istuttaminen tekee epätodennäköiseksi, että tietyn lajikkeen hyökkäykseen erikoistuneet klonaaliset viivat syntyvät. Tällaisessa tapauksessa valitut kannat erotetaan niiden monipuolisuudesta suhteessa kyseisiin lajikkeisiin, useimmilla niistä on lähellä virulenssigeenien enimmäismäärää. Tämä eroaa suuresti suurten maatalousyritysten pellolle tyypillisestä "klonaalisten viivojen" järjestelmästä, jossa on asianmukaisesti asennettu suoja myöhästyneeltä tuholta. "Klonaaliset viivat" (kun kaikki myöhäisrokotaudin taudinaiheuttajan kannat ovat yksi tai useampia genotyyppejä) ovat läsnä kaikissa maissa, joissa perunanviljelyä harjoittavat yksinomaan suuret maatilat: Yhdysvallat, Alankomaat, Tanska jne. Englannissa, Irlannissa, Puolassa, jossa kotitalouksien tontit ovat myös perinteisesti yleisiä Perunanviljelyssä yksityisissä puutarhoissa on myös suurempi genotyyppinen monimuotoisuus. 20-luvun lopulla ”kloonilinjat” olivat levinneet Venäjän Aasian ja Kaukoidän osissa (Elansky et ai., 2001), mikä johtuu ilmeisesti samojen lajikkeiden käytöstä yksinomaan oman tuotannon perunoiden istuttamiseen. Viime aikoina myös näiden alueiden tilanne alkoi muuttua kohti populaatioiden genotyyppisen monimuotoisuuden lisääntymistä.
Intensiivisten fungisidivalmisteiden puuttumisella on toinen suora seuraus - resistenttien kantojen kertymistä puutarhoihin ei ole. Tuloksemme osoittavat, että metalaksyyliresistenttejä kantoja löytyy huomattavasti harvemmin yksityisistä puutarhoista kuin kaupallisista istutuksista.
Yksityisille puutarhoille tyypillinen peruna- ja tomaattiistutusten läheisyys helpottaa kantojen siirtymistä näiden kasvien välillä, minkä seurauksena viime vuosikymmenellä perunoista eristettyjen kantojen joukossa niiden kantojen osuus, jotka kantavat geeniä resistenssille kirsikkatomaattilajikkeille (T1), joka oli aiemmin ominaista vain " tomaatti "kannat. T1-geenikannat ovat useimmissa tapauksissa erittäin aggressiivisia sekä perunoille että tomaateille.
Viime vuosina tomaatin myöhäinen rappeutuminen alkoi esiintyä monissa tapauksissa aikaisemmin kuin perunoilla. Tomaatin taimet voivat olla tartunnan saaneita maaperässä olevilla oosporeilla tai tomaatin siemenissä läsnä olevilla tai niitä kiinnittävillä oosporeilla (Rubin et ai., 2001). Viimeisten 15 vuoden aikana kauppoihin on ilmestynyt suuri määrä halpoja, pääasiassa maahantuotuja, pakattuja siemeniä, ja suurin osa pienistä tuottajista on siirtynyt käyttämään niitä. Siemenet voivat tuoda kantoja, joiden genotyypit ovat tyypillisiä niiden kasvualueille. Tulevaisuudessa nämä genotyypit sisältyvät yksityisten puutarhojen seksuaaliseen prosessiin, mikä johtaa täysin uusien genotyyppien syntymiseen.
Siten voidaan todeta, että yksityiset vihannespuutarhat ovat maailmanlaajuinen "sulatusuuni", jossa geneettisen materiaalin vaihdon seurauksena olemassa olevat genotyypit käsitellään ja syntyy kokonaan uusia. Lisäksi niiden valinta tapahtuu olosuhteissa, jotka poikkeavat suurilta tiloilta perunalle luotuista: sienitautipuristimen puuttumisesta, istutusten lajikkeiden yhtenäisyydestä, virus- ja bakteeri-infektioiden eri muodoista kärsivien kasvien hallitsevuudesta, tomaattien ja luonnonvaraisten yökerhojen läheisyydestä, aktiivisesta risteytyksestä ja oosporin muodostumisesta, mahdollisuudesta oosporien toimimaan infektion lähteenä seuraavana vuonna.
Kaikki tämä johtaa takapihan populaatioiden erittäin korkeaan genotyyppiseen monimuotoisuuteen. Epifytoottisissa olosuhteissa myöhäinen riekko leviää erittäin nopeasti kasvipuutarhoissa ja vapautuu valtavia määriä itiöitä, jotka lentävät läheisiin kaupallisiin istutuksiin. Saapuneilla itiöillä on kuitenkin tullut kaupallisille kentille oikealla maataloustekniikan ja kemiallisen suojan järjestelmällä, mutta niillä ei ole käytännössä mitään mahdollisuutta aloittaa epifytoosia kentällä, mikä johtuu fungisidille vastustuskykyisten ja viljeltyyn lajikkeeseen erikoistuneiden klonaalisten viivojen puuttumisesta.
Toinen ensisijaisen ymppäyksen lähde voi olla sairaita mukuloita, jotka ovat loukussa kaupallisissa taimeissa. Näitä mukuloita kasvatettiin pääsääntöisesti aloilla, joilla on hyvä maataloustekniikka ja intensiivinen kemiallinen suoja. Mukulat infektoivien isolaattien genotyypit mukautuvat oman lajikkeensa kehittymiseen. Nämä kannat ovat huomattavasti vaarallisempia kaupallisessa istutuksessa kuin yksityisistä puutarhoista peräisin olevat rokotteet. Tutkimuksemme tulokset tukevat myös tätä oletusta. Suurista pelloista eristetyt populaatiot, joilla on asianmukainen kemiallinen suojaus ja hyvä maataloustekniikka, eivät eroa suurella genotyyppisellä monimuotoisuudella. Usein nämä ovat useita kloonisia viivoja, jotka ovat erittäin aggressiivisia.
Kaupallisen siemenmateriaalin kannat voivat päästä kasvipuutarhojen populaatioihin ja olla mukana niissä käynnissä olevissa prosesseissa. Kasvipuutarhassa niiden kilpailukyky on kuitenkin paljon heikompi kuin kaupallisilla aloilla, ja pian ne lakkaavat olemasta klonaalisen linjan muodossa, mutta niiden geenejä voidaan käyttää "puutarhaväestössä".
Tartunnalla, joka kehittyy "vapaaehtoisissa" kasveissa ja teurastettujen mukuloiden kasoissa sadonkorjuun aikana, ei ole niin merkitystä Venäjälle, koska Venäjän tärkeimmillä perunanviljelyalueilla havaitaan maaperän syvä jäätyminen talvella, ja maaperään talvehtineista mukuloista peräisin olevat kasvit kehittyvät harvoin. Lisäksi, kuten kokeemme osoittavat, myöhäisrokotaudinaiheuttaja ei selviä negatiivisissa lämpötiloissa edes mukuloilla, jotka ovat säilyttäneet elinkelpoisuutensa. Kuivalla vyöhykkeellä, jossa varhaisperunoiden viljelyä harjoitetaan, myöhäinen riekko on melko harvinaista kuivan ja kuuman kasvukauden vuoksi.
Siksi havainnoimme tällä hetkellä P. infestans -populaatioiden jakautumista pelto- ja puutarhapopulaatioihin. Viime vuosina on kuitenkin havaittu prosesseja, jotka ovat johtaneet näiden populaatioiden genotyyppien lähentymiseen ja tunkeutumiseen.
Niistä voidaan todeta yleinen pientuottajien lukutaidon kasvu, edullisten siemenperunapakettien syntyminen, fungisidivalmisteiden leviäminen pienissä pakkauksissa ja väestön "kemian" pelon menetys.
Tilanteita syntyy, kun yhden toimittajan voimakkaan toiminnan ansiosta kokonaisiin kyliin istutetaan saman lajikkeen siemenmukulat ja niissä on pienet pakkaukset samoista torjunta-aineista. Voidaan olettaa, että saman lajikkeen perunoita löytyy läheisiltä kaupallisilta istutuksilta.
Toisaalta jotkut torjunta-ainealan yritykset edistävät "budjettikohtaisia" kemiallisia käsittelyjärjestelmiä. Tällöin suositeltujen hoitojen lukumäärä aliarvioidaan ja tarjotaan halvimpia sienitautien torjunta-aineita, eikä painopiste ole myöhäisrokotuksen kehittymisen estämisessä yläosien niittämiseen asti, vaan tiettyyn epifytotiinin viivästymiseen saannon lisäämiseksi. Tällaiset järjestelmät ovat taloudellisesti perusteltuja, kun ruokaperunoita kasvatetaan heikkolaatuisista siemenmateriaaleista, kun periaatteessa ei ole kyse korkean sadon saavuttamisesta. Kuitenkin tässä tapauksessa, toisin kuin puutarhapopulaatioissa, perunan tasoitettu geneettinen tausta edistää tiettyjen fysiologisten rotujen valintaa, jotka ovat erittäin vaarallisia tälle lajikkeelle.
Yleensä suuntaukset perunantuotannon "puutarha" - ja "pelto" -menetelmien lähentymiseen näyttävät meille melko vaarallisilta. Niiden kielteisten seurausten estämiseksi sekä koti- että kaupallisilla aloilla on valvottava sekä siemenperunavalikoimaa että yksityisille omistajille tarjottavien sienitautien torjunta-aineiden valikoimaa pienissä pakkauksissa sekä perunansuojajärjestelmien jäljittämistä ja sienitautien käyttöä kaupallisella alalla.
Yksityisen sektorin alueella ei ole myöhäisrokotuksen lisäksi myös Alternariaa. Suurin osa yksityisten kotitalouksien tonttien omistajista ei toteuta erityisiä toimenpiteitä suojellakseen Alternariaa vastaan, sekoittamalla Alternarian kehityksen yläosien luonnolliseen kuihtumiseen tai myöhäisrokkoon. Siksi Alternarian valtavan kehityksen myötä alttiille lajikkeille kotitalouksien tontit voivat toimia ymppälähteenä kaupallisissa istutuksissa.
Vaihtelumekanismit
Mutaatioprosessi
Koska mutaatioiden esiintyminen on satunnainen prosessi, joka etenee matalalla taajuudella, mutaatioiden esiintyminen missä tahansa lokuksessa riippuu tämän lokuksen mutaatiotiheydestä ja populaation koosta. Kun tutkitaan P. infestans -kantojen mutaatioiden taajuutta, määritetään yleensä selektiivisillä ravintoalustoilla kasvatettujen pesäkkeiden määrä kemiallisten tai fysikaalisten mutageenien käsittelyn jälkeen. Kuten taulukon 8 tiedoista voidaan nähdä, saman kannan mutaatiotaajuus eri lokuksilla voi vaihdella useita suuruusluokkia. Mutaatioiden suuri taajuus metallaksyyliresistenssissä voi olla yksi syy sille sitä vastustavien kantojen kertymiseen luonnossa.
Laboratoriokokeiden perusteella laskettu spontaanien tai indusoitujen mutaatioiden taajuus ei aina vastaa luonnollisissa populaatioissa esiintyviä prosesseja seuraavista syistä:
1. Asynkronisilla ydinfissioilla on mahdotonta arvioida mutaatioiden tiheyttä yhtä ydinsukupolvea kohti. Siksi useimmat kokeet tarjoavat tietoa vain suoraan mutaatioiden tiheydestä erottamatta kahta mutaatiotapahtumaa ja yhtä mitoosin jälkeistä tapahtumaa.
2. Yksivaiheiset mutaatiot yleensä heikentävät genomin tasapainoa, joten uuden ominaisuuden hankkimisen myötä organismin yleinen kunto heikkenee. Suurimmalla osalla kokeellisesti saaduista mutaatioista on heikentynyt aggressiivisuus, eikä niitä rekisteröidä luonnollisissa populaatioissa. Siten korrelaatiokerroin P. infestans -mutanttien resistenssin fenyyliamidifungisidille vastustuskyvyn ja kasvunopeuden välillä keinotekoisessa väliaineessa oli keskimäärin (-0,62) ja sienitautien vastustuskyky ja aggressiivisuus perunanlehdillä (-0,65) (Derevyagina et ai. , 1993), mikä osoittaa mutanttien heikon kunto. Mutaatioihin dimetomorfia vastustuskyvyssä liittyi myös elinkelpoisuuden voimakas lasku (Bagirova et ai., 2001).
3. Suurin osa spontaaneista ja indusoiduista mutaatioista on resessiivisiä eivätkä ilmene fenotyyppisesti kokeissa, mutta ne muodostavat luonnollisten populaatioiden piilevän vaihtelevuusvarannon. Laboratoriokokeissa eristetyillä mutanttikannoilla on hallitsevia tai puolidominanttisia mutaatioita (Kulish ja Dyakov, 1979). Ilmeisesti ydindiploidia selittää epäonnistuneet yritykset hankkia UV-säteilyn vaikutuksen alaisia mutantteja, jotka ovat virulentteja aiemmin resistentteihin lajikkeisiin (McKee, 1969). Kirjoittajan laskelmien mukaan tällaisia mutaatioita voi esiintyä alle 1: 500000 XNUMX: n taajuudella. Recessiivisten mutaatioiden siirtyminen homotsygoottiseen, fenotyyppisesti ilmentyneeseen tilaan voi tapahtua seksuaalisen tai aseksuaalisen rekombinaation vuoksi (katso alla). Jopa tässä tapauksessa mutaatio voidaan peittää villityyppisten ytimien hallitsevilla alleeleilla cenoottisessa (monituumaisessa) sienirihmassa ja kiinnittyä fenotyyppisesti vain mononukleaaristen zoosporien muodostumisen aikana.
Taulukko 8. P. infestans -mutaatioiden esiintyminen kasvua estävinä aineina nitrosometyyliurean vaikutuksesta (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
Yhteys | Mutaatiotaajuus |
Oksitetrasykliini | 6,9 10 X-8 |
Blasticidin S | X 7,2 10-8 |
Streptomysiini | 8,3 x10-8 |
Trihotesiini | 1,8 10 X-8 |
Sykloheksimidi | 2,1 10 X-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimethomorph | 6,3 10 X-7 |
Metalaxil | 6,9 10 X-6 |
Populaatiokokoilla on myös ratkaiseva rooli spontaanien mutaatioiden esiintymisessä. Hyvin suurissa populaatioissa, joissa solujen lukumäärä N> 1 / a, missä a on mutaationopeus, mutaatio lakkaa olemasta satunnainen ilmiö (Kvitko, 1974).
Laskelmat osoittavat, että perunapellon keskimääräisellä tartunnalla (35 täplää kasvia kohden) muodostuu päivittäin hehtaarille 8x1012 itiötä (Dyakov ja Suprun, 1984). Ilmeisesti tällaiset populaatiot sisältävät kaikki mutaatiot, jotka vaihtotyyppi sallii kussakin lokuksessa. Jopa harvinainen mutaatio, joka esiintyy taajuudella 10–9, saa tuhat yksilöä miljoonista, jotka elävät hehtaarilla perunapeltoa. Mutaatioille, jotka esiintyvät suuremmalla taajuudella (esimerkiksi 10-6), tällaisessa populaatiossa voi esiintyä useita parillisia mutaatioita päivittäin (samanaikaisesti kahdella lokuksella), ts. mutaatioprosessi korvaa rekombinaation.
Siirtymät
P. infestans -lehdelle tunnetaan kaksi päätyyppiä: muuttoliikkeiden sulkeminen (perunapellolla tai naapurialueilla) levittämällä eläintarhoja ilmavirralla tai sateella ja pitkiä matkoja - istuttamalla mukuloita tai kuljetettavia tomaattihedelmiä. Ensimmäinen menetelmä varmistaa taudin fokuksen laajentumisen, toinen - uusien polttopisteiden luominen paikkoihin, jotka ovat kaukana ensisijaisesta.
Tomaattimukuloiden ja hedelmien aiheuttama infektio leviää paitsi taudin ilmaantumiselle uusissa paikoissa, mutta on myös tärkein geneettisen monimuotoisuuden lähde populaatioissa. Moskovan alueella kasvatetaan perunoita, jotka tuodaan Venäjän ja Länsi-Euroopan eri alueilta. Tomaatin hedelmät tuodaan Venäjän eteläisiltä alueilta (Astrakhanin alue, Krasnodarin alue, Pohjois-Kaukasus). Tomaatinsiemeniä, jotka voivat toimia myös tartuntalähteinä (Rubin et al., 2001), tuodaan myös Venäjän eteläisiltä alueilta, Kiinasta, Euroopan maista ja muista maista.
E. Mayrin (1974) laskelmien mukaan paikallisten populaatioiden mutaatioiden aiheuttamat geneettiset muutokset ylittävät harvoin 10-5 lokusta kohden, kun taas avoimissa populaatioissa geenien vastavirtauksesta johtuva vaihto on vähintään 10-3-10-4.
Siirtyminen tartunnan saaneilla mukuloilla on vastuussa P. infestansin pääsystä Eurooppaan, joka leviää kaikkiin maailman alueisiin, joissa perunaa viljellään. ne aiheuttivat vakavimmat väestömuutokset. Myöhäinen perunanrikko ilmestyi Venäjän imperiumin alueella melkein samanaikaisesti sen esiintymisen kanssa Länsi-Euroopassa.
Koska tauti havaittiin ensimmäisen kerran vuosina 1846-1847 Baltian maissa ja vasta seuraavina vuosina se levisi Valkovenäjällä ja Venäjän luoteisosissa, sen länsi-eurooppalainen alkuperä on ilmeinen. Ensimmäinen myöhästyneen taudin lähde vanhassa maailmassa ei ole niin ilmeinen. Fry et ai. (Fry et ai., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin et ai., 1994) kehittämä hypoteesi viittaa siihen, että loinen tuli ensin Meksikosta Pohjois-Amerikkaan, jossa se levisi viljelykasvien kautta ja kuljetettiin sitten Länsi-Eurooppaan. (kuva 7).
Toistuvan ajautumisen ("pullonkaulan" kaksinkertainen vaikutus) seurauksena yksittäiset kloonit pääsivät Eurooppaan, jonka jälkeläiset aiheuttivat pandemian koko vanhan maailman alueella, jossa perunoita kasvatetaan. Todisteena tälle hypoteesille kirjoittajat mainitsevat ensinnäkin vain yhden tyyppisen parittelun (A1) yleisen esiintymisen ja toiseksi tutkittujen eri alueiden genotyyppien homogeenisuuden (kaikki ne perustuvat molekyylimarkkereihin, mukaan lukien 2 isotsyymilokia, DNA-sormenjälkikuviot ja mitokondrioiden DNA: n rakenne on identtinen ja vastaa USA: ssa kuvattua US-1-kloonia). Jotkut tiedot herättävät kuitenkin epäilyjä ainakin joistakin esitetyn hypoteesin säännöksistä. Analyysi P. infestansin mitokondrioiden DNA: sta, joka oli eristetty 40-luvun ensimmäisen epifytoottisen jakson aikana tartunnan saaneista herbariumperunanäytteistä, osoitti, että ne eroavat mitokondrioiden DNA: n rakenteesta US-1-kloonista, joka siis oli vähintään ei ainoa tartuntalähde Euroopassa (Ristaino ym., 2001).
Lopputuhatilanne huononi jälleen 80-luvun XNUMX-luvulla. Seuraavia muutoksia on tapahtunut:
1) Väestön keskimääräinen aggressiivisuus on lisääntynyt, mikä on johtanut erityisesti myöhäisrokotuksen haitallisimman muodon - varret ja varret - laajaan leviämiseen.
2) Perunan myöhäisrokotuksen esiintymisaika muuttui - heinäkuun lopusta heinäkuun alkuun ja jopa kesäkuun loppuun.
3) A2-parittelutyypistä, joka aiemmin puuttui vanhasta maailmasta, on tullut läsnä kaikkialla.
Muutoksia edelsi kaksi tapahtumaa: uuden sienitautien torjunta-aineen käyttö (metalaksyyli) (Schwinn ja Staub, 1980) ja Meksikon ilmaantuminen perunoiden maailman viejänä (Niederhauser, 1993). Tämän mukaisesti väestömuutoksille esitettiin kaksi syytä - parittelutyypin muuttuminen metalaksyylin vaikutuksesta (Ko, 1994) ja uusien, Meksikosta tartunnan saaneiden mukulakantojen massiivinen käyttöönotto (Fry ja Goodwin, 1995). Vaikka parityyppien väliset muunnokset metalaksyylin vaikutuksesta saatiin Ko: n lisäksi myös Moskovan valtionyliopiston laboratoriossa tehdyissä töissä (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), toinen hypoteesi on parempi. Toisen parittelutyypin esiintymisen ohella vakavia muutoksia tapahtui venäläisten P. infestans -kantojen genotyypeissä, mukaan lukien neutraaleissa geeneissä (isotsyymi- ja RFLP-lokukset) sekä mitokondrioiden DNA: n rakenteessa. Näiden muutosten monimutkaisuutta ei voida selittää metalaksyylin vaikutuksella; pikemminkin Meksikosta tuotiin massiivisesti uusia kantoja, jotka aggressiivisempana (Kato et ai., 1997) syrjäyttivät vanhat kannat (US-1) ja tulivat hallitseviksi populaatioissa. Muutos Euroopan populaatioiden koostumuksessa tapahtui hyvin lyhyessä ajassa - vuodesta 1980 vuoteen 1985 (Fry et ai., 1992). Entisen Neuvostoliiton alueella Virosta peräisin olevista kokoelmista löydettiin ”uusia kantoja” vuonna 1985, toisin sanoen aikaisemmin kuin Puolassa ja Saksassa (Goodwin ym., 1994). Viime kerralla Venäjän "vanha kanta US-1" eristettiin tartunnan saaneesta tomaatista Moskovan alueella vuonna 1993 (Dolgova et ai., 1997). Myös Ranskassa tomaatin istutuksista löydettiin "vanhoja" kantoja 90-luvun alkuun saakka, ts. Sen jälkeen kun ne olivat kadonneet pitkään perunoista (Leberton ja Andrivon, 1998). Muutokset P. infestans -kannoissa vaikuttivat moniin ominaisuuksiin, mukaan lukien ne, joilla on erittäin käytännöllinen merkitys, ja lisäsivät myöhäisrokotuksen haitallisuutta.
Seksuaalinen rekombinaatio
Jotta seksuaalinen rekombinaatio myötävaikuttaisi vaihtelevuuteen, on ensinnäkin välttämätöntä, että populaatiossa esiintyy kahden tyyppistä parittelua suhteessa lähellä 1: 1, ja toiseksi populaation alkuperäisen vaihtelun läsnäolo.
Parittelutyyppien suhde vaihtelee suuresti eri populaatioissa ja jopa eri vuosina yhdessä populaatiossa (taulukko 9,10, 90). Syitä tällaisiin dramaattisiin muutoksiin parittelutyyppien esiintymistiheydessä populaatioissa (kuten esimerkiksi Venäjällä tai Israelissa viime vuosisadan 2002-luvun alussa) ei tunneta, mutta uskotaan, että tämä johtuu kilpailukykyisempien kloonien käyttöönotosta (Cohen, XNUMX).
Jotkut epäsuorat tiedot osoittavat seksuaalisen prosessin kulun tietyinä vuosina ja tietyillä alueilla:
1) Moskovan alueen populaatioiden tutkimukset osoittivat, että 13 populaatiossa, joissa A2-parittelutyypin osuus oli alle 10%, kolmelle isotsyymilokukselle laskettu geneettinen kokonais monimuotoisuus oli 0,08 ja 14 populaatiossa, joissa A2: n osuus ylitti 30%, geneettinen monimuotoisuus oli kaksi kertaa korkeampi (0,15) (Elansky et ai., 1999). Siksi mitä suurempi on yhdynnän todennäköisyys, sitä suurempi on väestön geneettinen monimuotoisuus.
2) Parittelutyyppien suhteen populaatioissa ja oosporeiden muodostumisen voimakkuuden välinen suhde havaittiin Israelissa (Cohen ym., 1997) ja Alankomaissa
(Flier et ai., 2004). Tutkimuksemme osoittivat, että populaatioissa, joissa A2-parittelutyyppisten isolaattien osuus oli 62, 17, 9 ja 6%, oosporeja löydettiin 78, 50, 30 ja 15% analysoiduista perunanlehdistä (joissa oli vähintään 2 täplää).
Näytteissä, joissa oli vähintään kaksi täplää, oli paljon todennäköisemmin oosporia kuin näytteissä, joissa oli yksi täplä (vastaavasti 2 ja 1% näytteistä) (Apryshko et ai., 32).
Oosporit olivat paljon yleisempiä perunakasvin keski- ja alakerroksen lehdissä (Mytsa et al., 2015; Elansky et ai., 2016).
3) Joillakin alueilla on löydetty ainutlaatuisia genotyyppejä, joiden esiintyminen liittyy seksuaaliseen rekombinaatioon. Siten Puolassa vuonna 1989 ja Ranskassa vuonna 1990 glukoosi-6-
fosfaatti-isomeraasi (GPI 90/90). Koska aikaisemmin vain 10/90 heterotsygootteja kohdattiin 100 vuoden ajan, homotsygoottisuus johtuu seksuaalirekombinaatiosta (Sujkowski et ai., 1994). Kolumbiassa (USA) isolaatit, jotka yhdistävät A2: n GPI 100/110: lla ja A1: n GPI 100/100: lla, ovat yleisiä, mutta vuoden 1994 kauden lopussa (16. elokuuta ja 9. syyskuuta) kantoja, joilla on rekombinantti genotyypit (A1 GPI 100/110) ja A2 GPI 100/100) (Miller et ai., 1997).
4) Joissakin Puolassa (Sujkowski et ai., 1994) ja Pohjois-Kaukasiassa (Amatkhanova et al., 2004) olevissa populaatioissa sormenjälkien DNA-lokusten ja allotsyymiproteiinilokusten jakauma vastaa Hardy-Weinberg-jakaumaa, mikä osoittaa
seksuaalisen rekombinaation suuren osuuden populaatioiden vaihtelevuudesta. Muilla Venäjän alueilla ei löydy vastaavuutta Hardy-Weinberg-jakautumasta populaatioissa, mutta sidoksen epätasapaino esiintyi, mikä osoittaa klonaalisen lisääntymisen vallitsevuuden (Elansky et ai., 1999).
5) Eri parittelutyyppien (A1 ja A2) kantojen geneettinen monimuotoisuus (GST) oli pienempi kuin eri populaatioiden välillä (Sujkowski et ai., 1994), mikä epäsuorasti osoittaa seksuaalisia risteytyksiä.
Samanaikaisesti seksuaalisen rekombinaation osuus väestön monimuotoisuudesta ei voi olla kovin suuri. Tämä osuus laskettiin Moskovan alueen väestölle (Elansky et ai., 1999). Lewontinin (1979) laskelmien mukaan "rekombinaatio, joka voi tuottaa uusia variantteja kahdesta lokuksesta taajuudella, joka ei ylitä niiden heterotsygoottisuuksien tuloa, tulee tehokkaaksi vain, jos molempien alleelien heterotsygoottisuuden arvot ovat jo korkeat".
Kun Moskovan alueelle tyypillisen kahden tyyppisen pariliitoksen suhde on 4: 1, rekombinaatiotaajuus on 0,25. Todennäköisyys, että ylitetyt kannat ovat heterotsygoottisia kahdelle kolmesta tutkitusta isotsyymilokista tutkituissa populaatioissa, oli 0,01 (2 kantaa 177: stä). Siksi kaksoisheterotsygoottien esiintymisen todennäköisyys rekombinaation seurauksena ei saisi ylittää niiden tuloa kerrottuna ylitystodennäköisyydellä (0,25x0,02x0,02) = 10-4, ts. seksuaaliset rekombinantit eivät yleensä kuulu tutkittavaan kantanäytteeseen. Nämä laskelmat tehtiin Moskovan alueen populaatioille, joille oli tyypillistä suhteellisen suuri vaihtelu. Siperian kaltaisissa monomorfisissa populaatioissa seksuaalinen prosessi, vaikka se tapahtuu yksittäisissä populaatioissa, ei voi vaikuttaa niiden geneettiseen monimuotoisuuteen.
Lisäksi P. infestansille on tunnusomaista kromosomien usein väärä suuntaus meioosissa, mikä johtaa aneuploidiaan (Carter et ai., 1999). Tällaiset rikkomukset vähentävät hybridien hedelmällisyyttä.
Paraseksuaalinen rekombinaatio, mitoottinen geenimuunnos
Kokeissa P. infestans -kantojen silmukoinnista erilaisilla kasvun estäjillä resistenttien mutaatioiden avulla havaittiin molemmille estäjille resistenttien misolaattien esiintyminen (Shattock ja Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Kannat, jotka ovat vastustuskykyisiä kahdelle kasvun estäjälle, syntyivät myseelin heterokaryotisaatiosta, ja tässä tapauksessa ne katkaisivat mononukleaaristen zoosporien lisääntymisen aikana (Judelson, Ge Yang, 1998) tai eivät pilkkoutuneet yksisoluisissa jälkeläisissä, koska heillä oli tetraploideja (koska alkuperäiset isolaatit ovat diploideja , 1979). Heterotsygoottiset diploidit eriytyivät hyvin matalalla taajuudella haploidoitumisen, kromosomien poissaolon ja mitoottisen ylityksen vuoksi (Poedinok et ai., 1982). Näiden prosessien taajuutta voitaisiin lisätä tiettyjen heterotsygoottisia diploideja koskevien toimien avulla (esimerkiksi itävien itiöiden UV-säteilytys).
Vaikka kaksoisresistenssin omaavien vegetatiivisten hybridien muodostumista ei tapahdu vain in vitro, vaan myös mutanttien seoksella infektoiduissa perunan mukuloissa (Kulish et ai., 1978), on melko vaikeaa arvioida parasexual-rekombinaation merkitystä uusien genotyyppien syntymisessä populaatioissa. Haploidisaatiosta, kromosomien poissaolemisesta ja mitoottisesta ylittymisestä johtuvien segreganttien muodostumistiheys ilman erityisiä vaikutuksia on vähäinen (alle 10-3).
Heterotsygoottisten kantojen homotsygoottisten segreganttien esiintyminen voi perustua sekä mitoottiseen ylitykseen että mitoottiseen geenimuunnokseen, jota P. sojaessa esiintyy taajuudella 3 x 10-2 - 5 x 10-5 lokusta kohden, kannasta riippuen (Chamnanpunt et ai. , 2001).
Vaikka heterokaryonien ja heterotsygoottisten diploidien esiintymistiheys osoittautui yllättävän suureksi (saavuttaen kymmeniä prosentteja), tämä prosessi tapahtuu vain, kun samasta kannasta saadut mutantiviljelmät silmukoidaan. Kun käytetään erilaisia luonnosta eristettyjä kantoja, heterokaryotisaatiota ei tapahdu (tai esiintyy hyvin matalalla taajuudella) vegetatiivisen yhteensopimattomuuden vuoksi (Poedinok ja Dyakov, 1981; Anikina et ai., 1997b; Cherepennikova-Anikina ym., 2002). Tästä johtuen parasexual-rekombinaation rooli voidaan vähentää vain heterotsygoottisten ytimien sisäiseen rekombinaatioon ja yksittäisten geenien siirtymiseen homotsygoottiseen tilaan ilman seksuaalista prosessia. Tällä prosessilla voi olla epidemiologinen merkitys kannoissa, joissa on resessiivisiä tai puolivaltaisia fungisidiresistenssimutaatioita. Sen siirtyminen paratseksuaalisen prosessin aiheuttamaan homotsygoottiseen tilaan lisää mutaation kantajan vastustuskykyä (Dolgova, Dyakov, 1986).
Geenien eteneminen
Heterotalaislajit Phytophthora pystyvät risteytymään hybridi-oosporien muodostumisen kanssa (katso Vorob'eva ja Gridnev, 1983; Sansome et ai., 1991; Veld et ai., 1998). Kahden Phytophthora-lajin luonnollinen hybridi oli niin aggressiivinen, että se tappoi tuhansia leppäjä Yhdistyneessä kuningaskunnassa (Brasier et al., 1999). P. infestansia voi esiintyä muiden suvun lajien (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum jne.) Yhteydessä tavallisilla isäntäkasveilla ja maaperässä, mutta kirjallisuudessa on vähän tietoa mahdollisesta interspecifisten hybridien mahdollisuudesta. Laboratorio-olosuhteissa saatiin P. infestansin ja P. Mirabilisin välisiä hybridit (Goodwin ja Fry, 1994).
Taulukko 9. A2-parittelutyyppisten P. infestans -kantojen osuus maailman eri maissa vuosina 1990-2000 (avoimen kirjallisuuden lähteiden ja sivustojen www.euroblight.net, www.eucablight.org tietojen mukaan)
Maa | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Valko-Venäjä | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Belgia | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ecuador | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Viro | 8 (12) | ||||||||||
Englanti | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Suomi | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Ranska | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Unkari | 72 (32) | ||||||||||
Irlanti | 4 (145) | ||||||||||
Pohjoinen. Irlanti | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Alankomaat | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Norja | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Peru | 0 (34, 1984-86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Puola | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Skotlanti | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Ruotsi | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Wales | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Korea | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Kiina | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Kolumbia | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Uruguay | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Marokko | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Meksiko (Toluca) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Taulukko 10. A2-parittelutyyppisten P. infestans -kantojen osuus maailman eri maissa vuosina 2000--2011
Maa | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Itävalta | 65 (83) | ||||||||||
Valko-Venäjä | 42 (78) | ||||||||||
Belgia | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Sveitsi | 89 (19) | ||||||||||
Чехия | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Saksa | 95 (53) | ||||||||||
Tanska | 48 (52) | ||||||||||
Ecuador | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Viro | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Englanti | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Suomi | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Ranska | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Unkari | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Pohjoinen. Irlanti | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Alankomaat | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Norja | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Peru | 0 (36) | ||||||||||
Puola | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Skotlanti | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Ruotsi | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Slovakia | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Wales | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Korea | 46 (26) | ||||||||||
Brasilia | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Kiina | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Вьетнам | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Populaatioiden genotyyppisen koostumuksen dynamiikka
Muutoksia P. infestans -populaatioiden genotyyppisessä koostumuksessa voi tapahtua uusien kloonien migraation seurauksena muilta alueilta, maatalouskäytännöistä (lajikemuutos, sienitautien torjunta) ja sääolosuhteista. Ulkoiset vaikutukset vaikuttavat eri klooneihin elinkaaren eri vaiheissa; Siksi populaatiot kokevat vuosittain syklisiä muutoksia valikoivien geenien taajuuksissa johtuen muutoksesta geenin kulkeutumisen ja selektion hallitsevassa roolissa.
Lajikkeen vaikutus
Uudet lajikkeet, joilla on tehokkaat vertikaalisen resistenssin geenit (R-geenit), ovat voimakas selektiivinen tekijä, joka valitsee kloonit, joilla on komplementaarisia virulenssigeenejä P. infestans -populaatioissa. Perunalajikkeesta poikkeavan resistenssin puuttuessa, mikä estää patogeenipopulaation kasvun, populaatiossa hallitsevien kloonien korvaamisprosessi tapahtuu hyvin nopeasti. Joten Domodedovsky-lajikkeen, jolla on R3-resistenssigeeni, leviämisen jälkeen Moskovan alueella, tämän lajikkeen virulenttien kloonien taajuus kasvoi 0,2: sta 0,82: een yhden vuoden aikana (Dyakov, Derevjagina, 2000).
Virulenssigeenien (patotyyppien) taajuuksien muutos populaatioissa ei kuitenkaan tapahdu vain viljeltyjen perunalajikkeiden vaikutuksesta. Esimerkiksi Valko-Venäjällä vuoteen 1977 saakka dominoivat virulenssigeeneillä 1 ja 4 kloonit, mikä johtui perunalajikkeiden viljelystä resistenssigeeneillä R1 ja R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). 70-luvun 2002-luvun lopulla klooneilla esiintyi kuitenkin erilaisia virulenssigeenejä ja niiden yhdistelmiä, eikä komplementaarisia resistenssigeenejä koskaan käytetty perunan jalostuksessa (ylimääräiset virulenssigeenit) (Ivanyuk et ai., XNUMX). Syy tällaisten kloonien esiintymiseen johtuu ilmeisesti tarttuvan materiaalin siirtymisestä Eurooppaan Meksikosta perunan mukuloiden kanssa. Kotona nämä kloonit kehittyivät paitsi viljeltyjen perunoiden lisäksi myös luonnonvaraisilla lajeilla, joilla oli erilaisia resistenssigeenejä; siksi monien virulenssigeenien yhdistelmä genomissa oli välttämätön selviytymiselle näissä olosuhteissa.
Mitä tulee lajikkeisiin, joilla on epäspesifinen vastustuskyky, ne vähentävät taudinaiheuttajan lisääntymisnopeutta ja viivästyttävät sen populaatioiden kehittymistä, mikä, kuten jo mainittiin, on luvun funktio. Koska aggressiivisuus on polygeeninen, kloonit, jotka sisältävät suuremman määrän geenejä "aggressiivisuutta" varten, kertyvät nopeammin, sitä suurempi on populaation koko. Siksi erittäin aggressiiviset rodut eivät ole sopeutumistuotteita viljeltyihin lajikkeisiin, joilla on epäspesifinen vastustuskyky, vaan päinvastoin niitä havaitaan todennäköisemmin erittäin herkkien lajikkeiden istutuksissa, jotka ovat lois-itiöiden kasautuneita.
Niinpä Venäjällä P. Infestansin aggressiivisimmat populaatiot löytyivät vuotuisten epifytotosten alueilta (Sahalinin, Leningradin ja Brjanskin alueiden populaatiot). Näiden populaatioiden aggressiivisuus osoittautui korkeammaksi kuin Meksikon (Filippov et al., 2004).
Lisäksi vastustuskykyisten lajikkeiden lehtiin muodostuu vähemmän oosporeja kuin herkille (Hanson ja Shattock, 1998), toisin sanoen lajikkeen epäspesifinen vastustuskyky vähentää myös loisen rekombinaatiokykyjä ja vaihtoehtoisten talvitusmenetelmien mahdollisuutta.
Fungisidien vaikutus
Fungisidit eivät vähennä vain fytopatogeenisten sienien määrää, ts. vaikuttavat populaatioidensa määrällisiin ominaisuuksiin, mutta ne voivat myös muuttaa yksittäisten genotyyppien taajuuksia, ts. vaikuttaa populaatioiden laadulliseen koostumukseen. Fungisidien vaikutuksesta muuttuvien populaatioiden tärkeimpiä indikaattoreita ovat seuraavat: sienitautien vastustuskyvyn muutokset, muutokset aggressiivisuudessa ja virulenssissa sekä muutokset lisääntymisjärjestelmissä.
Fungisidien vaikutus populaatioiden vastustuskykyyn ja aggressiivisuuteen
Tämän vaikutuksen aste määräytyy ensinnäkin käytetyn sienitautien tyypin perusteella, joka voidaan ehdollisesti jakaa polysiittiin, oligosiitiin ja monosiittiin.
Ensin mainittu sisältää useimmat kontaktisienisienet. Resistenssiä heille (jos se on mahdollista) hallitsee suuri määrä hyvin heikosti ilmentäviä geenejä. Nämä ominaisuudet määräävät väestön resistenssin näkyvien muutosten puuttumisen fungisidihoidon jälkeen (vaikka joissakin kokeissa saavutettiin jonkin verran resistenssin kasvua). Kontaktifungisidillä suihkutuksen jälkeen säilynyt sienipopulaatio koostuu kahdesta kantaryhmästä:
1) Kannat, jotka on säilytetty kasvien alueilla, joita ei ole käsitelty lääkkeellä. Koska fungisidillä ei ollut yhteyttä, näiden kantojen aggressiivisuus ja vastustuskyky eivät muutu.
2) Fungisidien kanssa kosketuksissa olevat kannat, joiden pitoisuus kosketuspisteissä oli alhaisempi kuin tappava. Kuten edellä mainittiin, myös tämän väestön osan vastustuskyky ei muutu, johtuen fungisidin osittaisesta vahingollisesta vaikutuksesta jopa subletaalisina pitoisuuksina sienisolun aineenvaihduntaan, yleiseen kuntoon ja sen loiskomponenttiin, aggressiivisuuteen, laskuun (Derevyagina ja Dyakov, 1990).
Näin ollen jopa osalla väestöstä, joka ei ole kuollut ja joka on altistunut kosketukseen fungisidin kanssa, on heikko aggressiivisuus eikä se voi olla epifytoottien lähde. Siksi huolellinen hoito, joka vähentää sienitautien torjuntaan joutumattomien populaatioiden osuutta, on edellytys suojatoimenpiteiden onnistumiselle. Resistenssiä oligosiittifungisidille hallitaan useilla additiivisilla geeneillä.
Kunkin geenin mutaatio johtaa jonkin verran resistenssin lisääntymiseen, ja resistenssin yleinen aste johtuu tällaisten mutaatioiden lisäämisestä. Siksi resistenssin kasvu tapahtuu vaiheittain. Esimerkki resistenssin asteittaisesta lisääntymisestä ovat mutaatiot resistenssille fungisidille dimetomorfille, jota käytetään laajalti perunoiden suojaamiseen myöhäisrokolta. Dimetomorfin vastus on polygeeninen ja lisäaine. Yksivaiheinen mutaatio lisää hieman vastustuskykyä.
Jokainen seuraava mutaatio pienentää kohdekokoa ja siten seuraavien mutaatioiden taajuutta (Bagirova et ai., 2001). Populaation keskimääräisen vastustuskyvyn nousu toistettujen oligosiittifungisidikäsittelyjen jälkeen tapahtuu vaiheittain ja asteittain. Tämän prosessin nopeuden määrää vähintään kolme tekijää: resistenssigeenien mutaatioiden tiheys, resistenssikerroin (resistentin kannan tappavan annoksen suhde herkkään) ja resistenssigeenien mutaatioiden vaikutus kuntoon.
Kunkin seuraavan mutaation ilmaantuvuus on pienempi kuin edellinen, joten prosessilla on vaimennusluonne (Bagirova et ai., 2001). Jos kuitenkin rekombinaatioprosesseja (seksuaalisia tai parasexuaalisia) tapahtuu populaatiossa, on mahdollista yhdistää eri vanhempamutaatiot hybridikannassa ja nopeuttaa prosessia. Siksi panmix-populaatiot saavat vastustuskyvyn nopeammin kuin agamiikat, ja jälkimmäisissä populaatiot, joilla ei ole vegetatiivista yhteensopimattomuutta, ovat nopeammin kuin populaatiot jaettuna tällaisilla esteillä. Tässä suhteessa kantojen läsnäolo populaatioissa, jotka eroavat parittelutyypeistä, nopeuttaa vastustuskyvyn hankkimista oligosiitti-fungisidille.
Toinen ja kolmas tekijä eivät edistä dimetomorfia kestävien kantojen nopeaa kertymistä populaatioihin. Jokainen seuraava mutaatio kaksinkertaistaa resistenssin, mikä on merkityksetöntä, ja samalla vähentää sekä keinotekoisen ympäristön kasvunopeutta että aggressiivisuutta (Bagirova et ai., 2001; Stem, Kirk, 2004). Siksi luonnollisten P. infestans -kantojen joukossa ei ole käytännössä mitään resistenttejä kantoja, edes ne, jotka on kerätty dimetomorfilla käsitellyistä perunanistutuksista.
Oligosite-fungisidillä hoidettu populaatio koostuu myös kahdesta kantaryhmästä: ne, jotka eivät ole olleet kosketuksissa fungisidin kanssa, eivätkä siksi ole muuttaneet alkuperäisiä piirteitä (jos tästä ryhmästä löytyy resistenttejä kantoja, ne eivät keräänny herkkien kantojen korkeamman aggressiivisuuden ja kilpailukyvyn vuoksi), ja kannat, jotka ovat kosketuksissa fungisidin subletaalisten konsentraatioiden kanssa. Viimeksi mainittujen joukossa resistenttien kantojen kertyminen on mahdollista, koska täällä niillä on etuja herkkiin verrattuna.
Siksi oligosiittifungisidien käytössä ei ole tärkeää niinkään perusteellinen hoito kuin lääkkeen suuri pitoisuus, useita kertoja suurempi kuin tappava annos, koska vaiheittaisessa mutageneesissä mutatoitujen kantojen alkuperäinen vastustuskyky on alhainen.
Lopuksi mutaatiot resistenssissä monosiittifungisidille ovat erittäin ilmeikkäitä, toisin sanoen yksi mutaatio voi ilmoittaa korkean vastustuskyvyn herkkyyden täydelliseen menetykseen asti. Siksi populaatioiden vastustuskyvyn kasvu tapahtuu hyvin nopeasti.
Esimerkkejä sellaisista fungisidistä ovat fenyyliamidit, mukaan lukien yleisin fungisidimetalaksyyli. Resistenssimutaatiot sille nousevat esiin suurella taajuudella, ja mutanttien resistenssiaste on erittäin korkea - se ylittää herkän kannan tuhannen kertaisesti tai enemmän (Derevyagina et ai., 1993). Vaikka resistenttien mutanttien kasvuvauhti ja aggressiivisuus vähenevät systeemisen fungisidin aiheuttamien herkkien kantojen kuoleman taustalla, resistenttien populaatioiden määrä kasvaa nopeasti ja sen aggressiivisuus kasvaa samanaikaisesti. Siksi useiden vuosien sienitautien käytön jälkeen resistenttien kantojen aggressiivisuus voi paitsi vastata herkkien aggressiivisuutta myös ylittää sen (Derevyagina, Dyakov, 1992).
Vaikutus seksuaaliseen rekombinaatioon
Koska A2-parittelutyypin yleinen esiintyminen P. infestans -populaatioissa osui samaan aikaan metalaksyylin intensiivisen käytön kanssa myöhäistä rappeutumista vastaan, ehdotettiin, että metalaksyyli indusoi parittelutyypin muutoksen. P. parasiticassa tällainen muuntaminen klooribentin ja metalaksyylin vaikutuksesta todistettiin kokeellisesti (Ko, 1994). Yksittäinen kulku väliaineella, jolla on pieni metalaksyylipitoisuus, johti homotalallisten isolaattien syntymiseen metalaksyylille herkästä P. infestans -kannasta, jonka parittelutyyppi on A1 (Savenkova ja Cherepnikova-Anikina, 2002). Seuraavien siirtojen aikana väliaineilla, joissa oli korkeampi metalaksyylipitoisuus, ei havaittu yhtä A2-pariliitostyyppistä isolaattia, mutta useimmat isolaatit, kun ne ristitettiin A2-isolaattien kanssa, oosporien sijaan, muodostivat ruma myseeli-kertymiä ja olivat steriilejä. Resistentin kannan, jolla on A2-parittelutyyppi, kulkeminen väliaineille, joissa on suuri metalaksyylipitoisuus, antoivat meille mahdollisuuden havaita kolme parittelutyypin muutoksen muotoa: 1) täydellinen steriiliys ristitettynä A1- ja A2-isolaattien kanssa; 2) homotallismi (oosporien muodostuminen monokulttuurissa); 3) A2-parittelutyypin muuntaminen A1: ksi. Siten metalaksyyli voi aiheuttaa muutoksia pariutumistyypeissä P. infestans -populaatioissa ja siten seksuaalisen rekombinaation esiintymisen niissä.
Vaikutukset vegetatiiviseen rekombinaatioon
Jotkut antibioottiresistenssigeenit lisäävät hyfaalisen heterokaryotisaation ja ydindiploidisaation taajuutta (Poedinok ja Dyakov, 1981). Kuten aiemmin on todettu, hifien heterokaryotisaatio P. infestans -lajin eri kantojen fuusion aikana tapahtuu hyvin harvoin johtuen vegetatiivisen yhteensopimattomuuden ilmiöstä tässä sienessä. Joillekin antibiooteille vastustuskykyisillä geeneillä voi kuitenkin olla sivuvaikutuksia, jotka ilmaistaan vegetatiivisen yhteensopimattomuuden voittamisessa. Tätä ominaisuutta omisti 1S-1-mutanttinen streptomysiiniresistenssigeeni. Tällaisten mutanttien läsnäolo phytophthoran kenttäpopulaatioissa voi lisätä geenivirtaa kantojen välillä ja nopeuttaa koko populaation sopeutumista uusiin lajikkeisiin tai fungisidisiin.
Tietyt sienitautien torjunta-aineet ja antibiootit voivat vaikuttaa mitoottisen rekombinaation taajuuteen, mikä voi myös muuttaa genotyyppien esiintymistiheyksiä populaatioissa. Laajasti käytetty sienimyrkky benomyyli sitoutuu beeta-tubuliiniin, proteiiniin, josta sytoskeletonin mikrotubulukset rakennetaan, ja siten häiritsee kromosomien erottumisprosesseja mitoosin anafaasissa, mikä lisää mitoottisen rekombinaation taajuutta (Hastie, 1970).
Parfluorifenyylialaniinin sienitautien torjunta-aineella, jota käytetään hollantilaisen taudin hoitoon hirmuissa, on sama ominaisuus. Parafluorifenyylialaniini lisäsi rekombinaation tiheyttä heterotsygoottisissa diploideissa P. infestans (Poedinok et ai., 1982).
Sykliset muutokset populaatioiden genotyyppisessä koostumuksessa P. infestansin elinkaaressa
P. infestansin klassinen kehitysvaihe lauhkealla vyöhykkeellä koostuu 4 vaiheesta.
1) Väestön eksponentiaalisen kasvun vaihe (polysyklinen vaihe) lyhyillä sukupolvilla. Tämä vaihe alkaa yleensä heinäkuussa ja kestää 1,5-2 kuukautta.
2) Väestönkasvun pysäyttämisvaihe johtuu kudoksen osuuden voimakkaasta vähenemisestä tai epäsuotuisien sääolosuhteiden puhkeamisesta. Tämä vaihe maatiloilla, jotka suorittavat varhaisen sadonkorjuun ennen lehtien poistoa, putoaa vuosisyklistä.
3) Mukuloiden talvehtimisvaihe, johon liittyy väestön koon merkittävä väheneminen, joka johtuu mukuloiden tahattomasta tartunnasta, infektion hitaasta kehittymisestä niissä, mukuloiden uudelleentartunnan puuttumisesta, sairastuneiden mukuloiden mätänemisestä ja teurastuksesta normaaleissa varastointiolosuhteissa.
4) Maaperän ja taimien hitaan kehityksen vaihe (monosyklinen vaihe), jossa sukupolven kesto voi saavuttaa kuukauden tai enemmän (toukokuun lopusta - heinäkuun alkuun). Yleensä sairaita lehtiä on tällä hetkellä vaikea havaita edes erityisillä havainnoilla.
Eksponentiaalisen väestönkasvun vaihe (polysyklinen vaihe)
Lukuisat havainnot (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) osoittivat, että epifytotyypin alussa vallitsevat matalavirulenttiset ja hieman aggressiiviset kloonit, jotka korvataan myöhemmin virulenttisemmilla ja aggressiivisemmilla. väestön aggressiivisuuden kasvuvauhti on korkeampi, vähemmän vastustuskykyinen isäntäkasvien lajike.
Väestön kasvaessa sekä valikoivasti tärkeiden kaupallisiin lajikkeisiin (R1-R4) tuotettujen että selektiivisesti neutraalien (R5-R11) geenien pitoisuus kasvaa. Joten Moskovan lähellä olevissa populaatioissa vuonna 1993 keskimääräinen virulenssi heinäkuun lopusta elokuun puoliväliin kasvoi 8,2: sta 9,4: een, ja suurin kasvu havaittiin selektiivisesti neutraalilla virulenssigeenillä R5 (31: stä 86%: iin virulentteista klooneista) (Smirnov, 1996 ).
Väestön kasvunopeuden laskuun liittyy väestön loistaudin heikkeneminen. Siksi masennusvuosina sekä kilpailujen kokonaismäärä että erittäin virulenttien kilpailujen osuus on pienempi kuin epifytoottisissa kilpailuissa (Borisenok, 1969). Jos epifytoottisten korkeuksien sääolosuhteet muuttuvat epäsuotuisiksi myöhäisrokkoa varten ja perunatartunta vähenee, myös erittäin virulenttien ja aggressiivisten kloonien pitoisuus pienenee (Rybakova et ai., 1987).
Populaation virulenssiin ja aggressiivisuuteen vaikuttavien geenien taajuuksien kasvu voi johtua virulenttien ja aggressiivisten kloonien valinnasta sekapopulaatiossa. Valinnan osoittamiseksi kehitettiin menetelmä neutraalien mutaatioiden analysoimiseksi, jota käytettiin menestyksekkäästi hiivan kemostaattipopulaatioissa (Adams et ai., 1985) ja Fusarium graminearumissa (Wiebe et ai., 1995).
Blasticidin S: lle resistenttien mutanttien esiintymistiheys P. infestans -lajin kenttäpopulaatiossa laski samanaikaisesti populaation aggressiivisuuden kasvun kanssa, mikä viittaa hallitsevien kloonien muutokseen populaation kasvun aikana (Rybakova et ai., 1987).
Talvivaihe mukuloissa
Talvittamisen aikana perunan mukuloissa P. infestans -kantojen virulenssi ja aggressiivisuus vähenevät, ja virulenssin lasku tapahtuu hitaammin kuin aggressiivisuus (Rybakova ja Dyakov, 1990). Ilmeisesti populaation koon (r-selektio) nopeaan kasvuun suotuisissa olosuhteissa "ylimääräiset" virulenssigeenit ja korkea aggressiivisuus ovat hyödyllisiä, joten epifytoottisten lääkkeiden kehitykseen liittyy virulenttimpien ja aggressiivisimpien kloonien valinta. Ympäristön kyllästymisolosuhteissa, kun ei lisääntymisnopeudella, mutta olemassaolon pysyvyydellä epäsuotuisissa olosuhteissa (K-valinta) on tärkeä rooli, "ylimääräiset" virulenssi- ja aggressiivisuusgeenit heikentävät kuntoa, ja näiden geenien kloonit kuolevat ensin, niin että keskimääräinen aggressiivisuus ja väestön virulenssi vähenee.
Kasvillisuusvaihe maaperässä
Tämä vaihe on elinkaaren salaperäisin (Andrivon, 1995). Sen olemassaolo oletettiin puhtaasti spekulatiivisesti - koska ei ole tietoa siitä, mitä taudinaiheuttajalle tapahtuu pitkällä ajanjaksolla (joskus yli kuukaudessa) - perunan taimien ilmestymisestä taudin ensimmäisten pisteiden ilmaantumiseen. Havaintojen ja kokeiden perusteella sienen käyttäytyminen tällä elämänvaiheella rekonstruoitiin (Hirst ja Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
Sienen itiö voi muodostua tartunnan saaneista mukuloista maaperässä. Tuloksena olevat itiöt itävät hifoilla, jotka voivat kasvaa pitkään maaperässä. Ensisijaiset (muodostuvat mukuloista) ja toissijaiset (maaperän myseelissä) itiöt nousevat maaperän pinnalle kapillaarivirtojen kautta, mutta kykenevät tartuttamaan perunat vasta sen jälkeen, kun sen alemmat lehdet laskeutuvat ja joutuvat kosketuksiin maaperän pinnan kanssa. Tällaiset lehdet (nimittäin taudin ensimmäiset täplät löytyvät niistä) eivät muodostu heti, mutta perunan latvojen pitkäaikaisen kasvun ja kehityksen jälkeen.
Täten P. infestansin elinkaaressa voi olla olemassa myös saprotrofinen kasvillisuusvaihe. Jos elinkaaren loisvaiheessa aggressiivisuus on tärkein kuntokomponentti, niin saprotrofisen vaiheen valinnalla pyritään vähentämään loisominaisuuksia, kuten kokeellisesti on osoitettu joillekin fytopatogeenisille sienille (katso Carson, 1993). Siksi syklin tässä vaiheessa aggressiiviset ominaisuudet tulisi menettää voimakkaimmin. Mutta toistaiseksi ei ole tehty suoria kokeita yllä olevien oletusten vahvistamiseksi.
Kausivaihtelut vaikuttavat paitsi P. infestansin patogeenisiin ominaisuuksiin myös vastustuskykyyn fungisidille, joka kasvaa polysyklisessä vaiheessa (epifytoinnin aikana) ja vähenee talvisäilytyksen aikana (Derevyagina et ai., 1991; Kadish ja Cohen, 1992). Erityisen voimakas metalaksyyliresistenssin lasku havaittiin sairastuneiden mukuloiden istutuksen ja taudin ensimmäisten täplien esiintymisen välillä pellolla.
Lajikohtainen erikoistuminen ja sen kehitys
P. infestans aiheuttaa epidemioita kahdessa kaupallisesti tärkeässä viljelyssä, perunassa ja tomaatissa. Epiphytoties perunoilla alkoi pian sienen tultua uusille alueille. Tomaatin tappio havaittiin myös pian sen jälkeen, kun perunat olivat tulleet tartunnalle, mutta tomaatin epifytotosi havaittiin vasta sata vuotta myöhemmin - XNUMX-luvun puolivälissä. Tässä Hallegli ja Niederhauser kirjoittavat tomaattien tappiosta Yhdysvalloissa
(1962): ”Noin 100 vuoden ajan vuoden 1845 vakavan epifytotian jälkeen vain vähän tai ei lainkaan yrityksiä saada vastustuskykyisiä tomaattilajikkeita. Vaikka myöhäisrokotus kirjattiin tomaateille ensimmäisen kerran jo vuonna 1848, siitä ei tullut kasvin kasvattajien vakavaa huomiota ennen taudin voimakasta puhkeamista vuonna 1946. Venäjän alueella myöhäinen tomaatin riekko rekisteröitiin 60-luvulla. ”Pitkään tutkijat eivät kiinnittäneet huomiota tähän tautiin, koska se ei aiheuttanut merkittävää taloudellista vahinkoa. Mutta 70- ja 1979-luvuilla. XNUMX-luvun tomaatin myöhäisrokotusta havaitaan myös Neuvostoliitossa, lähinnä Ala-Volgan alueella, Ukrainassa, Pohjois-Kaukasuksella, Moldovassa ... ”(Balashova, XNUMX).
Siitä lähtien myöhäisrokotuksen aiheuttama tomaattitartunta on muuttunut vuosittain ja levinnyt koko teollisen ja kotiviljelyn alueelle ja aiheuttanut valtavia taloudellisia vahinkoja tälle sadolle. Mitä tapahtui? Miksi loisen ensimmäinen esiintyminen perunoissa ja tämän sadon epifytoottinen vaurio tapahtui melkein samanaikaisesti, ja miksi kesti vuosisata, ennen kuin epifytoosi ilmestyi tomaattiin? Nämä erot tukevat pikemminkin meksikolaista kuin eteläamerikkalaista tartuntalähdettä. Jos Phytophthora infestans -laji kehittyi Solanum-suvun meksikolaisia mukuloita kantavien lajien loisiksi, on ymmärrettävää, miksi samaan sukuun kuuluviin viljeltyihin perunoihin kuin Meksikon lajeihin vaikutti niin voimakkaasti, mutta johtuen siitä, että parasiitin kanssa ei tapahtunut samanaikaista kehitystä, joka ei kehittänyt spesifisen ja epäspesifisen resistenssin mekanismeja.
Tomaatti kuuluu sukun eri osaan, sen vaihtotyypillä on merkittäviä eroja mukulalajeista, joten huolimatta siitä, että tomaatti ei ole P. infestansin elintarvikealan erikoisalalla, sen vahingon intensiteetti ei ollut riittävä vakavien taloudellisten menetysten kannalta.
Epiphytotiesin esiintyminen tomaatissa johtuu loisen vakavista geneettisistä muutoksista, jotka lisäsivät sen sopeutumiskykyä (patogeenisuutta) loistettaessa. Uskomme, että uusi tomaatin parasiitiin erikoistunut muoto on M.Galleglyn kuvaama T1-rotu, joka vaikuttaa kirsikkatomaattilajikkeisiin (Red Cherry, Ottawa), joka on vastustuskykyinen perunoille laajalle levinneelle T0-rodulle (Gallegly, 1952). Ilmeisesti mutaatio (tai mutaatioiden sarja), joka muutti T0-rodun T1-roduksi ja johti kloonien syntymiseen, jotka olivat sopeutuneet voimakkaasti tomaatin voittamiseen. Kuten usein tapahtuu, patogeenisuuden lisääntyminen yhteen isäntään liittyi sen vähenemiseen toiseen, toisin sanoen syntyi alkuperäinen, vielä ei täydellinen spesifinen erikoistuminen - perunoihin (rotu T0) ja tomaateihin (rotu T1).
Mikä on todiste tästä olettamuksesta?
- Esiintyminen perunoilla ja tomaateilla. Tomaatinlehdillä T1-rotu on hallitseva, kun taas perunanlehdillä se on harvinaista. S.F.Bagirovan ja T.A. Oreshonkova (julkaisematon) Moskovan alueella vuosina 1991-1992 T1-rodun esiintyminen perunan istutuksissa oli 0% ja tomaatin istutuksissa - 100%; vuosina 1993-1995 - vastaavasti 33% ja 90%; vuonna 2001 - 0% ja 67%. Samanlaisia tietoja saatiin Israelista (Cohen, 2002). Kokeet perunan mukuloiden infektiolla T1-rodun isolaateilla sekä isolaattien T0 ja T1 seoksella osoittivat, että T1-rodun isolaatit ovat huonosti säilyneet mukuloissa ja korvataan T0-rodun isolaateilla (Dyakov et ai., 1975; Rybakova, 1988).
2) T1-kilpailun dynamiikka tomaattiistutuksissa. Tomaatinlehtien ensisijainen infektio suoritetaan T0-rodun isolaateilla, jotka hallitsevat infektion analysointia lehdille muodostuneissa ensimmäisissä paikoissa. Tämä vahvistaa loisten muuttoliikkeen yleisesti hyväksytyn mallin: T0-rotu tekee perunoiden infektioiden päämassan, mutta pieni määrä perunoissa säilytettyjä T1-klooneja, kerran tomaatin päällä, syrjäyttää T0-rodun ja kerääntyy epifytoottisen jakson loppupuolelle. On myös mahdollista, että T1-rodulla on vaihtoehtoinen tomaattilehtien infektiolähde, joka ei ole yhtä voimakas kuin perunan mukulat ja lehdet, mutta vakio. Siksi tällä lähteellä on heikko vaikutus tomaattia infektoivan populaation geneettiseen rakenteeseen, mutta se määrittää myöhemmin T1-rodun kertymisen (Rybakova, 1988; Dyakov et ai., 1994).
3) Aggressiivisuus perunoille ja tomaateille. Tomaatin ja perunanlehtien keinotekoinen infektio rodun T0 ja T1 isolaateilla osoitti, että ensimmäiset ovat aggressiivisempia perunoille kuin tomaatille, ja toiset ovat aggressiivisempia tomaatille kuin perunalle. Nämä erot ilmenevät ei-"oman" rodun isolaattien siirtymisestä sekapopulaatiosta kasvihuoneen lehtien kulkiessa (Dyakov et ai., 1975) ja peltoalueilla (Leberton et ai., 1999); erot minimaalisessa tarttuvassa kuormituksessa, latenssiajassa, tarttuvien pisteiden koossa ja itiötuotannossa (Rybakova, 1988; Dyakov et ai., 1994; Legard ym., 1995; Forbes et ai., 1997; Oyarzun ym., 1998; Leberton et ai. al., 1999; Vega-Sanchez et ai., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna et ai., 2004).
T1-rodun isolaattien aggressiivisuus tomaattilajikkeisiin, joilta puuttuu resistenssigeenejä, on niin korkea, että nämä isolaatit itiöivät lehdillä kuin ravintoalustalla nekrotisoimatta infektoitunutta kudosta (Dyakov et al., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) Perunoiden ja tomaattien virulenssi. T1-rotu vaikuttaa kirsikkatomaattilajikkeisiin, joissa on Ph1-resistenssigeeni, kun taas T0-rotu ei kykene tartuttamaan näitä lajikkeita, ts. on kapeampi virulenssi. Suhteessa erottimiin
Perunoiden R-geenit ovat käänteisesti yhteydessä toisin sanoen tomaatin lehdistä eristetyt kannat ovat vähemmän virulentteja kuin ”peruna” -kannat (taulukko 11).
5) Neutraalit markkerit. Neutraalien markkereiden analyysi perunoilla ja tomaateilla loisevien P. infestans -ryhmien populaatioissa todistaa myös monisuuntaisesta spesifisestä valinnasta. P. infestans -tablettien Brasilian populaatioissa tomaatinlehden isolaatit kuuluivat klonaaliseen linjaan US-1 ja perunanlehtien BR-1-linjaan (Suassuna et al., 2004). Floridassa (USA) vuodesta 1994 lähtien klooni US-90 alkoi dominoida perunoilla (esiintyvyys yli 8%) ja kloonit US-11 ja US-17 tomaatilla, ja jälkimmäisen isolaatit ovat aggressiivisempia tomaatille kuin perunalle (Weingartner , Tombolato, 2004). Merkittävät erot genotyyppitaajuuksissa (DNA-sormenjäljet) peruna- ja tomaatti-isolaateissa todettiin 1200 P. infestans -kannalle, jotka kerättiin Yhdysvalloissa vuosina 1989-1995 (Deahl et ai., 1995).
AFLP-menetelmän avulla voitiin erottaa 74 kantaa, jotka kerättiin peruna- ja tomaattilehdistä vuosina 1996-1997. Ranskassa ja Sveitsissä 7 ryhmässä. Peruna- ja tomaattikannat eivät eronneet selvästi, mutta "peruna" -kannat olivat geneettisesti monimuotoisempia kuin "tomaattikannat". Ensimmäisiä löydettiin kaikista seitsemästä klusterista ja jälkimmäiset vain neljästä, mikä viittaa jälkimmäisen erikoistuneempaan genomiin (Knapova ja Gisi, 2002).
6) Eristysmekanismit. Jos kahden isäntäkasvilajin loisen populaatiot kehittyvät kohti erikoistumisen kaventumista kohti "omaa" isäntäänsä, syntyy erilaisia pre- ja postmeioottisia mekanismeja, jotka estävät populaatioiden välisen geneettisen vaihdon (Dyakov ja Lekomtseva, 1984).
Useissa tutkimuksissa on tutkittu vanhempien kantojen lähteen vaikutusta hybridisaation tehokkuuteen. Kun risteytetään Solanum-suvun eri lajeista eristettyjä kantoja Ecuadorissa (Oliva et ai., 2002), havaittiin, että villit Solanaceae (klonaalinen viiva EC-2) -kannat, joiden paritus tyyppi A2, ovat ristiriidassa tomaatin (linja EC) kanssa -3) ja ristitty tehokkaimmin perunakannan (EC-1) kanssa.
Kaikkien hybridien todettiin olevan ei-patogeenisiä. Kirjoittajat uskovat, että hybridisaatioiden pieni prosenttiosuus ja patogeenisyyden väheneminen hybrideissä johtuvat populaatioiden lisääntymiseristyksen jälkeisistä mekanismeista.
Bagirova et ai. (1998) kokeissa risteytettiin suuri määrä peruna- ja tomaattikantoja T0- ja T1-rotujen ominaisuuksien kanssa. Hedelmällisimmät olivat tomaatista eristettyjen T1xT1-kantojen risteytykset (36 oosporia mikroskoopin näkökentässä, 44% oospore-itävyydestä), vähiten tehokkaat olivat eri isännistä eristettyjen T0xT1-rotujen risteytykset (pieni määrä kehittyviä ja itäneitä oosporeja, suuri osa abortoivia ja alikehittyneitä oosporeja) ... Perunoista eristettyjen T0-rodun isolaattien välisten risteytysten tehokkuus oli keskitasoa. Koska T0-rodun pääkanta vaikuttaa perunoihin, sillä on luotettava talvehtimislähde - perunan mukulat, minkä seurauksena oosporien merkitys talvistavien tartuntayksikköjen joukossa perunapopulaatioille on vähäinen. Mukautettu "tomaattimuoto" kykenee talvehtimaan tomaatin päällä oosporien muodossa (ks. Alla) ja säilyttää siten seksuaalisen prosessin korkeamman tuottavuuden. Korkean hedelmällisyytensä ansiosta T1 saa itsenäisen potentiaalin tomaatin ensisijaiseen infektioon. Knapovan ym. (Knapova et al., 2002) saamat tulokset voidaan tulkita samalla tavalla. Perunoista eristettyjen kantojen ja tomaattikantojen kanssa saatiin eniten oosporia - 13,8 neliömetriä kohti. väliaine (levinneisyys 5-19) ja väliprosentti oosporien itävyydestä (6,3 levinneisyydellä 0-24). Tomaateista eristettyjen kantojen risteytyksillä saatiin pienin prosenttiosuus oosporista (7,6, levinneisyys 4-12), ja niiden itävyys oli suurin (10,8). Perunoista eristettyjen kantojen väliset risteytykset antoivat keskimääräisen määrän oosporia (8,6, suurella tiedon sironnalla - 0-30) ja pienimmän prosenttiosuuden itosolujen itävyydestä (2,7). Siten perunoiden kannat ovat vähemmän hedelmällisiä kuin tomaatin, mutta populaatioristeytykset eivät antaneet huonompia tuloksia kuin populaatiot. On mahdollista, että erot Bagirovan et ai. venäläiset tutkijat työskentelivät 90-luvun alkupuolella eristettyjen kantojen kanssa ja sveitsiläiset tutkijat - 90-luvun lopulla eristettyjen kantojen kanssa.
Alhaisen hedelmällisyyden perusta voi olla kantojen heteroploidisuus. Jos Meksikon populaatioissa, joissa seksuaalinen prosessi ja primaarinen infektio oospore-jälkeläisillä on säännöllistä, suurin osa tutkituista P. Infestans -kannoista on diploideja, niin Vanhan maailman maissa havaitaan plopian polymorfismi (di-, tri- ja tetraploidikannat sekä heterokaryoottikannat, joissa on heteroploidisia ytimiä). ja kannat, joilla on erityyppisiä parittelutapoja, so. molemmat hedelmällisiä, eroavat ydinploidian suhteen (Therrien et ai., 1989, 1990; Whittaker et ai., 1992; Ritch, Daggett, 1995). Anteridian ja oogonian ytimien monimuotoisuus voi olla syy matalaan hedelmällisyyteen.
Mitä tulee hifien väliseen ydinvaihtoon anastomoosien aikana, tämän estää vegetatiivinen yhteensopimattomuus, joka hajottaa aseksuaaliset populaatiot moniksi geneettisesti eristetyiksi klooneiksi (Poedinok ja Dyakov, 1987; Gorbunova et ai., 1989; Anikina et ai., 1997b).
7) Populaatioiden lähentyminen. Yllä olevat tiedot osoittavat, että hybridisaatio "peruna" - ja "tomaatti" P. infestans -kantojen välillä on mahdollista. Eri isäntien vastavuoroinen uudelleeninfektio on myös mahdollista, vaikkakin pienemmällä aggressiivisuudella.
Vuonna 1993 tehty tutkimus vierekkäisten peruna- ja tomaattikenttien isolaattien populaatiomarkkereista osoitti, että noin neljännes tomaatinlehdistä eristetyistä isolaateista siirrettiin viereiseltä perunapellolta (Dolgova et ai., 1997). Teoriassa voitaisiin olettaa, että populaatioiden ero kahden isännän välillä kasvaisi ja johtaisi erikoistuneiden lajien sisäisten muotojen (esim. Peruna ja tl. Tomaatti) syntymiseen, varsinkin kun oosporit voivat jatkua kasvijätteissä (Drenth et al., 1995 ; Bagirova, Dyakov, 1998) ja tomaatin siemenet (Rubin et ai., 2001). Tämän vuoksi tomaateilla on tällä hetkellä kevään uusiutumisen lähde perunan mukuloista riippumatta.
Kaikki tapahtui kuitenkin toisin. Oosporien talvehtiminen antoi loiselle mahdollisuuden välttää elinkaarensa kapeimman vaiheen - maaperän kasvillisuuden monosyklisen vaiheen, jonka aikana loisominaisuudet heikkenevät, ja ne palautuvat vähitellen polysyklisessä vaiheessa kesällä.
Taulukko 11. Virulenssigeenien taajuudet perunan erilaistumislajikkeisiin P. infestans -kannoissa
Maa | Vuosi | Virulenssigeenien keskimääräinen lukumäärä kannoissa | Kirjoittaja | |
perunoista | tomaatista | |||
Ranska | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton et ai., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Ranska, Sveitsi | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002 |
Yhdysvallat | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin et ai., 1995 |
Yhdysvallat, Zap. Washington | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance et ai., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ecuador | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun et ai., 1998 |
Israel | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Venäjä, Mosk. alueella | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Venäjä, eri alueet | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaja ja muut. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Ensisijaisilla zoosporangioilla ja eläinosilla, jotka itävät oosporeja, on korkea loisaktiivisuus, varsinkin jos oosporit muodostuivat partenogeneettisesti kannan feromonien vaikutuksesta päinvastaisella parittelutyypillä. Siksi oosporeilla infektoiduista siemenistä kasvatettujen tomaatin taimien tarttuva materiaali on erittäin patogeenistä sekä tomaatille että perunalle.
Nämä muutokset johtivat toiseen väestön uudelleenjärjestelyyn, joka ilmaistiin epidemiologiselta kannalta seuraavina tärkeinä muutoksina:
- Tartunnan saaneista tomaatin taimista on tullut tärkeä perunan ensisijaisen tartunnan lähde (Filippov, Ivanyuk, henkilökohtaiset viestit).
- Epiphytoties perunoilla alkoi havaita jo kesäkuussa, noin kuukausi aikaisemmin kuin tavallisesti.
- Perunanistutuksissa T1-rodun prosenttiosuus kasvoi, mitä siellä oli aiemmin havaittu merkityksetöntä (Ulanova et al., 2003).
- Tomaatinlehdistä eristetyt kannat eivät enää eronneet perunakannoista virulenssissa virulenssigeenien perunan erilaisten tekijöiden suhteen ja alkoivat ylittää "peruna" -kannat aggressiivisuudessa paitsi tomaatin myös perunoiden kohdalla (Lavrova et ai., 2003; Ulanova et ai. , 2003).
Siten divergenssin sijasta esiintyi populaatioiden lähentymistä, yhden populaation syntyminen kahdelle isäntäkasville, joilla oli korkea virulenssi ja aggressiivisuus molemmille lajeille.
Johtopäätös
Joten huolimatta P. infestansin yli 150 vuoden intensiivisestä tutkimuksesta biologiassa, mukaan lukien tämän viljeltyjen yksiväristen kasvien tärkeimpien sairauksien aiheuttajan populaatiobiologia, on paljon tuntematonta. Ei ole selvää, miten elinkaaren yksittäisten vaiheiden kulku vaikuttaa populaatioiden rakenteeseen, mitkä ovat geneettiset mekanismit aggressiivisuuden ja virulenssin kanavoidulle vaihtelulle, mikä on lisääntymis- ja klonaalisten lisääntymisjärjestelmien suhde luonnollisissa populaatioissa, miten vegetatiivinen yhteensopimattomuus periytyy, mikä on perunoiden ja tomaattien rooli näiden kasvien ensisijaisessa tartunnassa ja mikä on niiden vaikutus loisen populaatiorakenteeseen. Tähän mennessä tärkeitä käytännön kysymyksiä, kuten geneettisiä mekanismeja loisen aggressiivisuuden muuttamiseksi tai epäspesifisen perunaresistenssin eroosiota, ei ole ratkaistu. Perunan myöhäisrokotustutkimuksen syventämisen ja laajentamisen myötä loinen asettaa tutkijoille uusia haasteita. Kokeellisten ominaisuuksien parantaminen, uusien metodologisten lähestymistapojen ilmaantuminen geenien ja proteiinien käsittelyyn antavat meille kuitenkin mahdollisuuden toivoa esitettyjen kysymysten onnistunutta ratkaisua.
Artikkeli julkaistiin lehdessä "Potato Protection" (nro 3, 2017)