D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Kasvipatogeeninen sieni Colletotrichum coccodes aiheuttaa vaarallisia sairauksia perunoissa ja tomaateissa, jotka tunnetaan nimellä antraknoosi ja mukulan musta täplä. Morfologisten ominaisuuksiensa perusteella niitä on usein vaikea erottaa muiden mikro-organismien aiheuttamista sairauksista; vihreillä tomaattihedelmillä tauti voi olla oireeton, ja se ilmenee vain kypsillä punaisilla hedelmillä. Taudinaiheuttajan nopeaa ja tarkkaa diagnosointia varten tarjotaan reaaliaikainen PCR-testijärjestelmä. Testijärjestelmän kehittämiseksi määritettiin 45 ° C: n glyserolitrifosfaattidehydrogenaasigeenin nukleotidisekvenssi perunan mukuloista eristetyistä kannoista Venäjän eri alueilla.
Saatujen tulosten ja GenBank-tietokannassa olevien muiden lajien samankaltaisten sekvenssien analyysin perusteella suunniteltiin lajikohtaiset alukkeet ja koetin C. coccodesille. Luodun testijärjestelmän spesifisyyden tarkistamiseksi PCR tehtiin DNA: lla, joka oli eristetty 15 eri tomaatti- ja perunakasveihin liittyvän loista ja saprotrofisen sienilajin (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes) puhtaista viljelmistä. Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Colletotrichum coccodes DNA: n läsnäolo määritettiin kynnyssyklillä 20–27, kun taas muita lajeja havaittiin 40 syklin jälkeen tai niitä ei havaittu. Testausjärjestelmän avulla voidaan havaita luotettavasti C. coccodes-DNA-pitoisuudet, jotka ylittävät 0.01 ng / mm3 analysoidussa PCR-seoksessa. Kehitetyn testijärjestelmän avulla tutkittiin C. coccodesin esiintymistä tomaatinlehdissä, joissa oli sienitautien oireita, ja perunamukuloissa ilman taudin ulkoisia oireita. Lehtiä, joilla on sieni-infektion oireita, kerättiin kahdelta eri kentältä Krasnodarin alueella, mukulat - Kostroman, Moskovan, Kalugan ja Nižni Novgorodin alueiden pelloilta. Yksi C. coccodes DNA: ta sisältävä tomaatin lehti löydettiin Krasnodarin alueelta; merkittävä läsnäolo tämän patogeenin DNA: sta havaittiin viidessä mukulanäytteessä, joita kasvatettiin Kostroman, Moskovan, Kalugan alueilla.
Esittely
Colletotrichum-suvun sienet ovat vaarallisia fytopatogeeneja, jotka vaikuttavat viljaan, vihanneksiin, yrtteihin, monivuotisiin hedelmä- ja marjakasveihin. Yksi tämän suvun läsnä olevista lajeista, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes on perunoiden ja tomaattien antraknoosin ja mustan täplän aiheuttaja ja aiheuttaa useiden muiden Solanaceae-perheen kasvien, mukaan lukien, tauteja. rikkaruohot (Dillard, 1992). C. coccodes tartuttaa kaikki kasvin maanalaiset osat, varren pohjat, lehdet ja hedelmät (Andrivon et ai., 1998; Johnson, 1994). Tartunnan saaneiden perunan mukuloiden kuoressa havaitaan harmaiden täplien kehittyminen epäselvästi ilmaistuilla reunoilla, joihin mustat itiöpisteet ja mikrosklerotiat ovat selvästi näkyvissä. Varastoinnin aikana mukuloiden massaan voi muodostua pehmennetyn sisällön haavaumia, ts. tauti siirtyy antraknoosivaiheeseen, mikä on kuitenkin erittäin harvinaista.
Samanaikaisesti antraknoosin oireet (ihohaavat, joissa on pieniä mustia pisteitä) ovat tyypillisiä tomaattihedelmille. Lehdillä C. coccodesin oireet näkyvät tummanruskeaina täplinä, joita yleensä reunustaa keltainen kudos (Johnson, 1994).
Mustapaikan kehittyminen mukuloissa pilaa niiden ulkonäön, mikä on erityisen selvää, kun myydään pestyjä punakuori-perunoita. Kuorinnan kuorinta johtaa ylimääräiseen haihtumiseen ja lisääntyneisiin varastointihäviöihin (Hunger, McIntyre, 1979). Muiden kasvielinten vaurioituminen johtaa satohäviöihin, jotka havaittiin sekä avoimessa että suljetussa maassa (Johnson, 1994; Tsror et ai., 1999). C. coccodesin aiheuttamat sairaudet ovat yleisiä melkein kaikilla perunanviljelyalueilla maailmassa, myös Venäjällä (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Näiden sairauksien hallinta on vaikeaa johtuen nykyisten fungisidien riittämättömästä tehokkuudesta C. coccodesia vastaan ja resistenttien lajikkeiden puuttumisesta (Read, Hide, 1995).
C. coccodes -siirros voi jatkua siemen mukuloissa (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), tomaatin siemenissä (Ben-Daniel et al., 2010), selviytyä pitkään maaperässä, kasvijätteillä (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) ja rikkaruohoissa (Raid, Pennypacker, 1987). Useiden kirjoittajien teokset (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et ai., 1997; Dillard, Cobb, 1993) ovat osoittaneet, että taudin kehittyminen perunoissa ja tomaateissa riippuu suurelta osin ympyrän läsnäolosta siemenissä ja maaperään. Siksi taudista aiheutuvien menetysten minimoimiseksi on tarpeen diagnosoida (mukaan lukien kvantitatiivinen) sienen leviäminen siemenmateriaalissa, maaperässä, varastointiin asetetuissa siemenperunan mukuloissa ja tomaatin siemenissä. Morfologinen diagnoosi maaperässä ja kasvimateriaalissa voidaan suorittaa vain mikrosklerotioiden läsnä ollessa, joita kuitenkin löytyy myös muuntyyppisistä sienistä.
Mukuloiden oireet ovat hyvin samankaltaisia kuin Helminthosporium solani -sienteen aiheuttama hopeakärki. Colletotrichum coccodesin ja Helminthosporium solanin eristäminen puhtaaksi viljelmäksi on melko vaikeaa ja kestää kauan ravinteiden hitaan kasvun takia. Colletotrichum-kokkokoodien nopea tunnistaminen edellyttää instrumentaalisia diagnostisia menetelmiä. Kätevin menetelmä on polymeraasiketjureaktio (PCR) ja sen modifikaatio - reaaliaikainen PCR. Tällä hetkellä brittiläisten tutkijoiden (Cullen et al., 2002) kehittämää testijärjestelmää rDNA: n ITS1-alueelle käytetään Euroopassa ja Yhdysvalloissa. Sen käyttö on osoittanut hyviä tuloksia venäläisten isolaattien analyysissä (Belov et al, 2018). C. coccodes on kuitenkin erittäin vaihteleva ja sen havaitseminen yhdestä DNA-sekvenssistä voi johtaa vääriä negatiivisiin tuloksiin. Luotettavampaan diagnoosiin tarvitaan analyysi useille lajikohtaisille DNA-sekvensseille, joiden yhteydessä olemme kehittäneet alkuperäisen testijärjestelmän, joka mahdollistaa C. coccodesin tunnistamisen glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasigeenin sekvenssin perusteella.
Materiaalit ja menetelmät
Luotujen testijärjestelmien tehokkuuden ja spesifisyyden arvioimiseksi käytimme puhtaan viljelmän 15 sienilajista, jotka kirjoittajat eristivät sairaista tomaatti- ja hedelmänäytteistä, perunamukuloista (taulukko 1). Eristystä varten otettiin sieni-infektion oireita omaavien kasvien elimet, enintään yksi elin per pensas.
Viipale mukulaa, jossa on kuori, viipale tomaattihedelmää ja sairas lehti asetettiin binokulaarimikroskoopin alle, minkä jälkeen myseeli, itiöt tai kudospala siirrettiin agar-väliaineeseen (vierre-agar) Petri-astiassa teroitetulla leikkausneulalla. Isolaatteja säilytettiin agar-vinoilla koeputkissa 4 ° C: ssa.
Analysoitaviksi tarkoitetut näytteet tomaatinlehdistä, joilla on sienitautien oireita, asetettiin välittömästi keräämisen jälkeen (kentällä) 70-prosenttiseen etyylialkoholiin, jossa niitä varastoitiin DNA-eristykseen asti. Perunan mukulat toimitettiin laboratorioon, kuorittiin (2 × 1 cm kappale) niistä ja pakastettiin –20 ° C: seen. Säilytetään pakastettuna DNA-eristykseen asti.
Puhtaita sieniviljelmiä DNA-eristämistä varten kasvatettiin nestemäisessä herne-alustassa. Sienen sienirihmasto poistettiin nestemäisestä väliaineesta, kuivattiin suodatinpaperilla, jäädytettiin nestetypessä, homogenoitiin, inkuboitiin CTAB-puskurissa, puhdistettiin kloroformilla, saostettiin isopropanolin ja 0.5 M kaliumasetaatin seoksella ja pestiin kahdesti 2-prosenttisella alkoholilla. Tuloksena oleva DNA liuotettiin deionisoituun veteen ja varastoitiin -70 ° C: seen (Kutuzova et ai., 20). DNA-pitoisuus mitattiin käyttämällä HS-DNA-kvantifiointipakkausta kaksisäikeiselle DNA: lle Qubit 2017: lla (Qiagen, Saksa). Alkoholisoidut ja jäädytetyt näytteet hierrettiin nestetypessä, mitä seurasi DNA-eristys, kuten edellä on kuvattu (puhtaiden sieniviljelmien myseeliä varten).
Taulukko 1. Käytettyjen sienikantojen alkuperä
Sienen nimi | Kasvi, urut | Valintapaikka |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | perunan mukula | Kostroman alue, 1. kentän sukupolven perunamukulat, lajike Red Scarlett |
Colletotrichum coccodes 4 | perunalehti | Edustaja Mari El, Joshkar-Ola |
Helminthosporium solani | perunan mukula | Magadanin alue, pos. Teltta, perunamukula |
Cladosporium fulvum | tomaatin lehtiä | Moskovan alue, suurihedelmäinen tomaatti |
Alternaria tomatophila | tomaatti hedelmät | luovuttanut All-Venäjän kasvinsuojelun tutkimuslaitoksen mykologian ja fytopatologian laboratorion henkilökunta |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | tomaatti hedelmät | Krasnodarin alue, Krymskyn piiri, voide |
Fusarium oxysporum | vehnänjuuri | Moskovan alue |
PCR suoritettiin DTprime-vahvistimella (DNA-tekniikka). PCR: ssä käytettiin alkuperäisiä alukkeita ja koetinta glyserolitrifosfaattidehydrogenaasigeenin lajikohtaiselle alueelle: eteenpäin suuntautuva aluke Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, käänteisaluke Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. Alukkeet monistavat 213 emäsparin alueen.
Reaktioon kului 50 ng kokonais-DNA: ta (lehtien ja mukuloiden analyysissä) ja 10 ng (puhtaan sieniviljelmän DNA: n analyysissä). Reaktioseos (35 μl) erotettiin parafiinikerroksella kahteen osaan: alempi (20 μl) sisälsi 2 μl 10 x reaktiopuskuria (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM kutakin deoksinukleotiditrifosfaattia, 7 pmol kutakin aluketta ja 4 pmol hydrolysoitavaa fluoresoivaa koetinta; ylempi sisälsi 1 μl 10 x PCR-puskuria ja 1 U Taq-polymeraasia.
Seoksen erottaminen parafiinilla sallii putkien varastoinnin pitkään 5 ° C: n lämpötilassa ja PCR-reaktion kuumakäynnistyksen, kun niitä on kuumennettu 10 minuuttia yli 80 ° C: n lämpötilassa. PCR suoritettiin seuraavan ohjelman mukaisesti: 94.0 ° C - 90 s (1 sykli); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 sykliä); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 sykliä); 10.0 ° C - varastointi.
tulokset ja keskustelu
Glyserolitrifosfaattidehydrogenaasigeenin sekvenssit määritettiin 45 kannasta, jotka oli eristetty lehdistä, varret, perunamukulat ja tomaattihedelmät (Kutuzova, 2018) Venäjän eri alueilla. Kaikkien kantojen tutkitut sekvenssit jaettiin kahteen ryhmään, jotka eroavat kahdesta nukleotidista. Molempien ryhmien edustajien nukleotidisekvenssit numeroilla KY2 ja KY496634 talletetaan GenBankiin.
Alukkeet coc70gdf, coc280gdr ja niiden perusteella suunnitellut cocgdz-koetin tarkistettiin BLAST-ohjelmalla (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) kaikista Colletotrichum-suvun lajien glyserolitrifosfaattidehydrogenaasigeenin sekvensseistä ja muista GenBank-tietokannassa olevista organismeista.
Muiden alukkeiden ja koettimien kanssa erittäin homologisten organismien DNA-alueita ei löytynyt.
Testijärjestelmän herkkyys tarkastettiin käyttämällä näytteitä, joissa oli eri pitoisuuksia C. coccodes DNA: ta, antraknoosilla infektoituneen perunanlehden DNA: ta (kerätty vuonna 2017 Mari Elissa, Red Scarlett -lajike) ja mustan täplän vahingoittamien mukuloiden kuorta (kerätty Kostroman alueella, lajike Red Scarlett, taulukko 2). DNA: n läsnäolon varmistamiseksi mukuloissa ja perunanlehdissä C. coccodes -kannat eristettiin niistä puhtaisiin viljelmiin.
Testijärjestelmän herkkyysanalyysin tulokset osoittavat, että sitä voidaan käyttää onnistuneesti diagnosoimaan C. coccodes DNA: n esiintyminen näytteessä, kun sen kokonaispitoisuus PCR-seoksessa on yli 0.05 ng. Tämä riittää havaitsemiseen, koska yksi sklerotia sisältää keskimäärin 0.131 ng ja yksi itiö sisältää noin 0.04 ng DNA: ta (Cullen et ai., 2002). Englantilaisen ryhmän (Cullen et ai., 2002) kehittämä testijärjestelmä osoitti samanlaista herkkyyttä (kynnysjakso 34 0.05 ng: n DNA: lla ja 37 0.005 ng: lla).
C. coccodesia sisältävien luonnollisten näytteiden analyysi mahdollisti kaikissa tapauksissa luotettavasti paljastaa sen esiintymisen näytteessä (taulukko 2). Ehdotettu menetelmä DNA: n eristämiseksi oli sovellettavissa myös luonnollisten kasvinäytteiden analyysiin.
Taulukko 2. Ehdotetun testijärjestelmän herkkyyden määrittäminen Colletotrichum-kokkokoodien tunnistamiseksi reaaliaikaiselle PCR: lle
näyte | DNA-määrä näytteessä *, ng | Kynnysjakso | C. kokkodeiden havaitseminen |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Mukulan kuori 1 | 50 | 32 | + |
Mukulan kuori 2 | 50 | 30 | + |
Mukulan kuori 3 | 50 | 31.5 | + |
Perunanlehti | 50 | 29.5 | + |
Merkintä. * PCR-tuotteiden seoksessa.
Testijärjestelmän spesifisyys testattiin DNA-näytteillä, jotka oli uutettu 15 sienilajista. Kirjoittajat eristivät kaikki sienikannat vaurioituneista ja terveistä hedelmistä ja tomaatin lehdistä, perunamukulat; yksi kanta eristettiin vehnänjuuresta (taulukko 1). Hedelmän pinnalta eristettyjen lajien joukossa on myös lajeja, jotka eivät ole patogeenisiä tomaatille (esimerkiksi Phellinus ferrugineovelutinus).
Tutkimukset ovat osoittaneet, että C. coccodes-DNA havaittiin kynnysjaksolla 20–27, kun taas muita sienilajeja ei havaittu tai ne antoivat signaalin syklin 40 jälkeen, mikä johtuu epäspesifisestä meluvaikutuksesta (taulukko 3).
Taulukko 3. Testijärjestelmän tarkistus erityyppisille sienille
Sienen nimi | Kynnysjakso |
Colletotrichum coccodes 1 | 20.9 |
C. coccodes 2 | 22.6 |
C. coccodes 3 | 23 |
C. coccodes 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Merkintä. * DNA: n määrä kaikissa näytteissä oli 10 ng.
Kehitettyä testijärjestelmää käytettiin tunnistamaan C. coccodes tomaatinlehtinäytteistä, joissa oli nekrotrofisten patogeenien oireita ja siemenperunan mukuloita ilman näkyviä oireita. Tutkimusta varten otimme eri lajikkeiden siemenmukulat, joita kasvatettiin Kostroman, Moskovan, Kalugan ja Nižni Novgorodin alueilla. C. coccodes DNA: n läsnäoloa pidettiin merkittävänä näytteissä, joiden analyysissä kynnyssykli ei ylittänyt 35. Tämä kynnysarvo valittiin perustuen luotettavaan 0.05 ng: n C. coccodes DNA: n määritykseen (kynnyssykli 33.5, taulukko 2) ja siihen, että kynnyssyklit yli 40, diagnosoitiin joidenkin muiden sienilajien epäspesifinen DNA. Tällä lähestymistavalla C. coccodes DNA: n merkittävä esiintyminen havaittiin viidessä mukulanäytteessä, joita kasvatettiin Kostroman, Moskovan ja Kalugan alueilla, ja yhdessä tomaattilehdessä Krasnodarin alueen Yeisk-alueelta (taulukot 5, 4).
Taulukko 4. Colletotrichum-kokkokoodien havaitseminen perunan mukuloista *
Näytteen numero | Erilaisia perunoita | Kasvupaikka | C. kokkodeiden havaitseminen | Kynnysjakso |
---|---|---|---|---|
1 | Punainen Scarlet | Kostroman alue | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Moskovan alue | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky aikaisin | Moskovan alue | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Kalugan alue. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | fantasia | Kalugan alue. | - | |
15 | gaala | Nizhny Novgorodin alueella. | - | |
16 | - |
Merkintä. * DNA: n määrä kaikissa näytteissä oli 50 ng.
Taulukko 5. Colletotrichum-kokkokoodien havaitseminen tomaatin lehdillä *
Näytteen numero | Kasvupaikka | C. kokkodeiden havaitseminen | Kynnysjakso |
---|---|---|---|
1 | Krasnodarin alue, Krimin alue | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodarin alue, Yeiskin alue | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* DNA: n määrä kaikissa näytteissä oli 50 ng.
Luomamme testijärjestelmä ei ole herkkyydeltään ja spesifisyydeltään huonompi kuin brittiläisten tutkijoiden (Cullen et ai., 2002) kehittämä ja soveltuu kasvinäytteiden analysointiin. Sen soveltaminen siemen mukuloiden analysointiin mahdollisti C. coccodes DNA: n tunnistamisen mukuloissa ilman ulkoisia vaurion merkkejä ja lehtien tartunnan analysoinnin.
Venäjällä ei ole toistaiseksi tehty analyysejä perunamukuloista C. coccodes -infektion varalta. Ensimmäinen tutkimuksemme osoitti, että Venäjän federaation eri alueilla kasvatetuista 16 testatusta siemenmukulasta 5 sisältää C. coccodes. Tämä osoittaa, että perunan mukuloiden musta täplä on Venäjällä yleinen perunatauti, ja sen roolia perunasadon määrän ja laadun vähentämisessä on aliarvioitu.
Tomaattilehtien analyysi paljasti merkittävän C. coccodes DNA: n läsnäolon yhdessä Krasnodarin alueen Yeisk-alueen lehdessä. Aiemmin eteläisen Venäjän tomaattipeltoja tutkittaessa brittiläisen testijärjestelmän avulla (Cullen et ai., 2002) havaittiin C. coccodes -lehtiä sisältäviä lehtiä, ja joillakin aloilla löydettiin suuri osa C. coccodes -infektion saaneista lehdistä (Belov et al. 2018). Krasnodarin ja Primorskin alueilta, Moskovan alueelta, löysimme tomaattihedelmiä, joista onnistuimme eristämään puhtaat C. coccodes -viljelmät. On mahdollista, että C. coccodes on paljon levinneempi tomaatilla Venäjällä kuin nyt uskotaan, ja myös sen haitallisuutta aliarvioidaan.
Siksi tähän mennessä on kerätty riittävästi tietoa C. coccodesin laajasta levinneisyydestä perunoilla ja tomaateilla.
Tämän sienen roolin ymmärtämiseksi paremmin peruna- ja tomaattitautien kehittymisessä on välttämätöntä seurata sen esiintyvyyttä Venäjällä, tutkia maaperän ja siementen infektioiden roolia sekä mustan täplän merkitystä varastointihäviöissä. PCR-diagnostiikan käyttö voi helpottaa merkittävästi tätä työtä, ja molempien testijärjestelmien samanaikainen käyttö lisää merkittävästi analyysin tarkkuutta.
Tätä työtä tuki Venäjän tiedesäätiön apuraha nro 18-76-00009.
Artikkeli julkaistiin lehdessä "Mycology and Phytopathology" (osa 54, nro 1, 2020).