SYÖDÄ. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Äskettäin on osoitettu, että ascomycete-sieni Ilyonectria crassa pystyy tartuttamaan perunan mukulat. Tämä työ on ensimmäinen, joka analysoi perunoista eristetyn I. crassa -kannan biologisia ominaisuuksia ja vastustuskykyä joillekin sienitautien torjunta-aineille. ”Perunakannan” lajikohtaisten alueiden sekvenssit osuivat samaan aikaan kuin ne, jotka saatiin aiemmin narsissin, ginsengin, haavan ja pyökin, liljasipulien ja tulppaaninlehtien juurista eristetyille sienille. Ilmeisesti monet villi- ja puutarhakasvit voivat olla I. crassan varantoja. Tutkittu kanta tarttui tomaatti- ja perunaviipaleihin, mutta ei tartuttanut koko tomaatin hedelmää ja ehjää perunamukulaa. Tämä osoittaa, että I. crassa on haavan loinen. Fludioksoniili-, difenokonatsoli- ja atsoksistrobiiniresistenssin arviointi ravintoalustalla osoitti näiden lääkkeiden korkean tehokkuuden.
EC50-indikaattori (sienitautien torjunta-aineen pitoisuus, joka hidastuu kaksinkertaisesti pesäkkeen radiaalisen kasvunopeuteen verrattuna ei-sienitautien torjuntaan) oli 2; 0.4 ja 7.4 mg / l. I. crassan aiheuttaman taudin kehittymisen mahdollisuus olisi otettava huomioon perunan mukuloiden fytopatologisessa arvioinnissa ja kasvinsuojelutoimien kehittämisessä.
Fytopatogeenisten mikro-organismien kehittyminen johtaa suuriin tappioihin perunoiden kaikissa kasvatus- ja varastointivaiheissa. Suojatoimenpiteitä suunniteltaessa otetaan yleensä huomioon tunnetut taudinaiheuttajat, kuten suvut Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora jne. Viime vuosina on kuitenkin tullut yhä enemmän raportteja uusien fytopatogeenisten mikro-organismien esiintymisestä perunoissa. Niiden biologiaa on tutkittu huonosti, perunoissa käytettyjen fungisidien tehokkuutta suhteessa niihin ei tunneta, diagnostisia menetelmiä ei ole kehitetty. Massakehityksen myötä ne pystyvät aiheuttamaan merkittävää vahinkoa perunasadolle. Yksi näistä mikro-organismeista on ascomycete-sieni Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, jonka tekijät löysivät ensimmäisen kerran perunamukuloista (Chudinova et al., 2019).
Tämä työ esittelee perunan mukuloista eristetyn I. crassa -kannan analyysin tulokset. Tutkittiin I. crassan pesäkkeiden ja myseelirakenteiden morfologiaa, lajispesifisten DNA-alueiden nukleotidisekvenssejä, virulenssia perunoille ja tomaateille sekä vastustuskykyä joillekin suosituille fungisidille.
Materiaalit ja menetelmät
Käytimme vuonna 18 eristettyä I. crassa 2KSuPT2018 -kantaa Kostroman alueella kasvatetusta tartunnan saaneesta perunamukulasta. Mukulaan vaikutti kuiva mädäntyyppi, jonka ontelo oli peitetty vaaleanruskealla myseelillä. Käyttämällä steriiliä leikkausneulaa, sienirihmasto siirrettiin Petri-maljaan agar-väliaineella (olutvirre 10%, agar 1.5%, penisilliini 1000 U / ml). Levyjä inkuboitiin pimeässä 24 ° C: ssa.
Leica DM2500 -valomikroskooppia ICC50 HD -digitaalikameralla ja Leica M80 -kiikarmikroskooppia IC80HD-digikameralla (Leica Microsystems, Saksa) käytettiin itiöiden ja itiöelinten koon ja morfologian kuvaamiseen, arviointiin.
DNA: n eristämiseksi sienirihmastoa kasvatettiin nestemäisessä herne-elatusaineessa, sitten se pakastettiin nestetypessä, homogenoitiin, inkuboitiin CTAB-puskurissa, puhdistettiin kloroformilla ja pestiin kahdesti 2-prosenttisella alkoholilla.
DNA-uuttomenetelmä on kuvattu yksityiskohtaisesti artikkelissa Kutuzova et ai. (2017).
Lajin määrittämiseksi molekyylimenetelmillä ja vertaamiseksi muihin tunnettuihin I. crassa -kantoihin PCR suoritettiin alukkeilla, jotka mahdollistivat lajispesifisten DNA-alueiden amplifikaation: ITS1-5,8S-ITS2 (alukkeet ITS5 / ITS4, White et ai., 1990), geenialueet b -tuliini (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) ja translaation venytystekijä la (tef1a) (alukkeet EF1-1F / EF728-1R, Carbone ja Kohn, 986). Halutun pituiset amplikonit uutettiin geelistä käyttämällä Evrogen CleanUp -pakkausta. Monistetut alueet sekvensoitiin käyttämällä BigDye® Terminator v1999 -syklisekvensointipakettia (Applied Biosystems, CA, USA) automatisoidulla Applied Biosystems 3.1 xl -sekvensserillä (Applied Biosystems, CA, USA). Saatuja nukleotidisekvenssejä käytettiin vastaavuuden etsimiseen Yhdysvaltain kansallisen bioteknologian tiedotuskeskuksen (NCBI) GenBank-tietokannasta. Fylogeneettinen analyysi suoritettiin käyttäen MEGA 3730 -ohjelmaa (Tamura et ai., 6).
Virulenssin määrittäminen suoritettiin suurihedelmäisen tomaatin (Dubrava-lajike) ja perunan mukuloiden (Gala-lajike) kokonaisilla vihreillä hedelmillä. Lisäksi vaurioituneiden hedelmien ja mukuloiden vaurioiden simuloimiseksi käytimme samojen hedelmien ja mukuloiden viipaleita. Mukulaviipaleet sijoitettiin kosteisiin kammioihin, jotka olivat Petri-maljoja, joiden pohjassa oli märkä suodatinpaperi. Paperille asetettiin dia, jolle puolestaan laitettiin viipaleita mukuloita tai hedelmiä. Kokonaiset mukulat ja hedelmät sijoitettiin myös astioihin, joissa oli märkä suodatinpaperi pohjassa. Viipaleen keskelle (tai mukulan tai hedelmän ehjälle pinnalle) asetettiin pala agaria (5 × 5 mm) sienihifien kanssa viiden päivän kasvun jälkeen vierre-agarilla.
Sienikantojen resistenssin arviointi fungisidille tehtiin laboratorio-olosuhteissa agar-ravintoalustalla. Tutkimme herkkyyttä sienitautien torjunta-aineille Maxim, KS (vaikuttava aine fludioksoniili, 25 g / l), Quadris, KS (atsoksistrobiini 250 g / l), Scor, EC (difenokonatsoli 250 g / l) (valtion luettelo ..., 2020). Arviointi suoritettiin Petri-maljoilla vierre-agar-alustalla lisäämällä tutkittuja lääkkeitä aktiivisen aineen 0.1 pitoisuuksina; yksi; 1 ppm (mg / l) (fludioksoniilille ja difenokonatsolille), 10; kymmenen; 1 ppm (atsoksistrobiinille) ja alustassa ilman fungisidia (kontrolli). Fungisidit lisättiin sulatettuun ja jäähdytettiin 10 ° C: n väliaineeseen, minkä jälkeen väliaine kaadettiin Petri-maljoihin. Agar-lohko, jossa oli sienirihmasto, sijoitettiin Petri-maljan keskelle ja viljeltiin 100 ° C: n lämpötilassa pimeässä. Seitsemän päivän inkuboinnin jälkeen pesäkkeiden halkaisijat mitattiin kahdessa keskenään kohtisuorassa suunnassa; kunkin pesäkkeen mittaustulokset keskiarvoistettiin. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. Analyysien tulosten perusteella laskettiin EC60, yhtä suuri kuin fungisidin pitoisuus, joka puolitti pesäkkeen radiaalisen kasvunopeuden suhteessa fungisidiseen kontrolliin.
tulokset ja keskustelu
Vierre-agarilla varustetuissa petrimaljoissa sieni muodosti pesäkkeitä, joissa oli valkoista flokkulenttia myseeliä. Rihmaston alla oleva väliaine muuttui punaruskeaksi. Kun väliaine kuivuu, sieni muodosti kahden tyyppisiä itiöitä yksittäisille ja yhdistetyille konidioforeille pienissä sporodokioissa. Makrokonidiat ovat pitkänomaisia, sylinterimäisiä, yhdestä kolmeen väliseinää, keskimääräinen pituus 27.2 um, arvoalueella 23.2 - 32.2 um, leveys - 4.9 um (kuvio 1). Mikrokonidioiden keskimääräinen pituus on 14.3 um, arvoalue on 10.3 - 18.1 um, leveys on enintään 4.0 um. Kaikki makro- ja mikromorfologiset hahmot sopivat Ilyonectria crassa -lajin vaihtelualueeseen (Cabral et al., 2012).
Lajikohtaisten DNA-alueiden (ITS, b-tubuliini, TEF la) sekvenssit osuivat täysin yhteen aikaisemmin tutkittujen I. crassa -kantojen sekvenssien kanssa (Chudinova et ai., 1, taulukko 2019). I. crassan esiintyvyyden tutkimiseksi muilla alueilla ja sairastuneiden viljelmien spektrin analysoimiseksi analysoitiin analogisia DNA-sekvenssejä GenBank-tietokannassa (taulukko 1). Päällekkäisyys oli 1-86%. ”Peruna” I. crassa -kannan kaikkien kolmen DNA-alueen sekvenssit olivat identtiset Hollannin liljasipuli- ja narsissijuurista ja Kanadan ginsengijuurista eristettyjen kantojen sekvenssien kanssa. Emme löytäneet muita I. crassa -kantoja, joissa oli kolme analysoitua samanlaista sekvenssiä avoimista tietokannoista. Talletettujen ITS- ja b-tubuliinisekvenssien analyysi osoitti kuitenkin I. crassan läsnäolon tulppaanilehdillä Isossa-Britanniassa. Sienet, joilla on samanlainen ITS-sekvenssi, tunnistettiin analysoimalla haavan juurien mykobiota Kanadassa ja pyökin juuret Italiassa, perunamukulat Saudi-Arabiassa (taulukko 100). Tämän tutkimuksen tulokset osoittavat, että I. crassa on levinnyt maailmanlaajuisesti ja kykenee tartuttamaan erilaisia kasvilajeja.
Tomaatin ja perunan viipaleilla patogeenisyyttä määritettäessä 5. päivänä vaurion halkaisija oli 1.5 cm.Tässä tapauksessa tutkittu kanta ei tartuttanut koko tomaattihedelmää ja ehjää perunamukulaa. Tomaatissa oli kuitenkin vaikutusta verholehtiin. Saastumismahdollisuuden poissulkemiseksi perunan mukulaviipaleelle kehitetty sieni-isolaatti sienirihmasta eristettiin puhtaaseen viljelmään. Se oli täysin identtinen vanhempien kannan kanssa. Ilmeisesti I. crassa on haavan loinen.
Siementen mukuloiden istuttamista edeltävä sienitautien torjunta vähentää kasvien sairauksien kehittymistä kasvukauden aikana. Tehokkaiden fungisidien valinnassa on tärkeää arvioida, mitkä niistä ovat tehokkaita I. arerassaa vastaan. Työssä tutkittiin fungisidien yleisiä aktiivisia aineita - fludioksoniili, atsoksistrobiini, difenokonatsoli. Fludioksoniili sisältyy useisiin seoksiin, joita käytetään siementen ja siementen mukauttamiseen ennen istutusta. Fludioksoniilia (Maxim) käytetään myös siementen mukuloiden käsittelyyn ennen varastointia. Difenokonatsoli ja atsoksistrobiini sisältyvät myös useisiin siemenmateriaalin käsittelyssä käytettäviin valmisteisiin sekä kasvullisten kasvien käsittelyyn tarkoitettuihin valmisteisiin (valtion luettelo ..., 2020).
I. crassan kasvunopeutta tutkittiin väliaineilla (kuva 2), joissa oli eri pitoisuuksia vaikuttavia aineita: fludioksoniili (EC50 = 0.4 ppm), atsoksistrobiini (EC50 = 4 ppm) ja difenokonatsoli (EC50 = 7.4 ppm) (taulukko 2). Näiden valmisteiden voidaan katsoa olevan erittäin tehokkaita I. crassaa vastaan, koska niiden EC50 on merkittävästi alhaisempi kuin valmisteen suositeltu pitoisuus mukuloiden hoitoon käytetyssä työaineessa. Valtion luettelon ... (2020) mukaan fludioksoniilin pitoisuus nesteessä perunan mukuloiden hoitamiseksi on 500-1000 ppm, atsoksistrobiini (nesteessä vakojen pohjan käsittelyyn) - 3750-9375 ppm, difenokonatsoli (kasvin kasvien hoitoon tarkoitetussa nesteessä) - 187.5– 625 ppm.
Taulukko 1. Genbank-tietokannasta saatavien 18KSuPT2- ja Ilyonectria crassa -kantojen lajikohtaisten sekvenssien samankaltaisuus
Kanta | Isäntäkasvi, erittymispaikka | GenBankiin talletetut järjestysnumerot, prosenttiosuus samankaltaisuuksista | Linkki | ||
SEN | β-tubuliini | TEF 1a | |||
17KSPT1 ja 18KSuPT2 | Perunan mukula, Kostroman alue | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et ai., 2019, tämä työ |
CBS 158/31 | Narsissin juuret, Alankomaat | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et ai., 2012 |
CBS 139/30 | Lily-polttimo, Alankomaat | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Ginseng-juuret, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS 235138 | Tulppaanilehti, Iso-Britannia | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Haavan juuret, Kanada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield et ai., 2020 |
ER1937 | Pyökki, Italia | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Suora toimittaminen |
KAUF19 | Perunan mukula, Saudi-Arabia | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = ei talletettu
Taulukko 2. Ilyonectria crassan vastustuskyky fungisidille
(vaikuttava aine) | EC50, ppm | ||||
3 päivä | 5 päivä | 7 päivä | |||
Ohjaa | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, Kalifornia (fsoxistrobiini) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioksoniili) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EY (difenokonatsoli) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
Työssämme I. crassa -kannat eristettiin perunan mukuloista Kostroman ja Moskovan alueilla (Chudinova et al., 2019). Suuri osa sienikannoista, joiden ITS-sekvenssit olivat identtiset I. crassan kanssa, paljastettiin analysoitaessa perunamukuloiden mykobiota Saudi-Arabiassa (Gashgari ja Gherbawy, 2013). Ilmeisesti I. crassa ei ole niin harvinainen perunoilla kuin se saattaa tuntua. Kokeemme osoittivat, että sieni voi tartuttaa vaurioituneita tomaatin hedelmiä. Kirjallisuudesta tiedetään, että I. crassa kykenee kehittymään maaperässä saprotrofisesti (Moll et ai., 2016) sekä vaikuttamaan moniin kasveihin, jopa taksonomisesti kaukaisiin, kuten narsissit, liljat, ginseng, haapa ja pyökki (taulukko 1). yksi). Ilmeisesti monet villi- ja puutarhakasvit voivat olla I. crassan varantoja. Edellä esitetty osoittaa, että suojatoimenpiteitä kehitettäessä on otettava huomioon mahdollisuus vaikuttaa perunan mukuloihin tällä sienellä. Fludioksoniilia, atsoksistrobiinia ja difenokonatsolia sisältävien perunan mukuloiden hoitoon on laajasti käytetty valmisteita fungisidisesti tehokkaasti I. crassaa vastaan.
Tätä työtä tuki Venäjän perustutkimuksen säätiö (apuraha 20-016-00139).
Artikkeli julkaistiin lehdessä "Plant Protection Bulletin", 2020, 103 (3)